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Nov 12, 2023

Nature Chemical Biology Band 18, Seiten 385–393 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Zellfreie Biosensoren sind leistungsstarke Plattformen zur Überwachung der Gesundheit von Mensch und Umwelt. Hier erweitern wir ihre Fähigkeiten, indem wir sie mit fußgesteuerten Strangverdrängungsschaltkreisen verbinden, einer dynamischen DNA-Nanotechnologie, die molekulare Berechnungen durch programmierbare Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuresträngen ermöglicht. Wir entwickeln Designregeln für die Verbindung einer Kleinmolekül-Sensorplattform namens ROSALIND mit der durch den Zehengriff vermittelten Strangverdrängung, um hybride RNA-DNA-Schaltkreise zu konstruieren, die eine Feinabstimmung der Reaktionskinetik ermöglichen. Wir verwenden diese Entwurfsregeln, um 12 verschiedene Schaltkreise zu bauen, die eine Reihe von Logikfunktionen implementieren (NOT, OR, AND, IMPLY, NOR, NIMPLY, NAND). Abschließend demonstrieren wir eine Schaltung, die wie ein Analog-Digital-Wandler funktioniert und eine Reihe binärer Ausgänge erzeugt, die den Konzentrationsbereich des detektierten Moleküls kodieren. Wir glauben, dass diese Arbeit einen Weg zur Entwicklung „intelligenter“ Diagnostika ebnet, die molekulare Berechnungen nutzen, um die Geschwindigkeit und den Nutzen von Biosensoren zu verbessern.

Die zellfreie Biosensorik entwickelt sich zu einer kostengünstigen, benutzerfreundlichen und vor Ort einsetzbaren diagnostischen Technologieplattform, mit der eine Reihe chemischer Verbindungen im Zusammenhang mit der Gesundheit von Mensch und Umwelt nachgewiesen werden können1,2. Im Kern bestehen diese Systeme aus zwei Schichten: einer RNA- oder proteinbasierten Biosensorschicht und einer Reporterkonstrukt-Ausgabeschicht. Durch die genetische Verdrahtung dieser Schichten wird ein Signal erzeugt, wenn die Zielverbindung an den Biosensor bindet und die Reporterexpression aktiviert (Abb. 1). Reaktionen werden zusammengestellt, indem diese Schichten in zellfreie Systeme eingebettet und zur einfachen Lagerung, zum Transport und zur Rehydrierung mit einer interessierenden Probe am Ort des Bedarfs gefriergetrocknet werden1,3. Mit diesem Ansatz haben zellfreie Biosensoren erfolgreich Verbindungen nachgewiesen, die für die menschliche Gesundheit relevant sind, wie Zink4 und Quorum-Sensing-Moleküle aus pathogenen Bakterien5, Arzneimitteln wie Gamma-Hydroxybutyrat6 und Wasserverunreinigungen wie Fluorid1, Atrazin2, Antibiotika und Schwermetalle7.

(Oben) Ein zellfreier Biosensor wird typischerweise aktiviert, wenn eine Zielverbindung (Input) an einen Proteintranskriptionsfaktor (Sensorschicht) bindet, der so konfiguriert ist, dass er die Expression eines Reporterkonstrukts (Outputschicht) aktiviert. Dies führt zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals wie Fluoreszenz. (Unten) Das Hinzufügen einer nachgeschalteten Informationsverarbeitungsschicht vor der Signalerzeugung kann die Leistung verbessern und die Funktion zellfreier Biosensoren erweitern, indem Rechenfunktionen wie Logikverarbeitung und Signalvergleich hinzugefügt werden. Hier wird dies durch die Verdrahtung der Biosensor-Ausgangsschicht umgesetzt, um eine einzelsträngige RNA zu erzeugen, die in der Lage ist, fußvermittelte Strangverdrängungsschaltkreise zu aktivieren, die Signale erzeugen.

Allerdings fehlt bestehenden zellfreien Biosensoren oft eine Informationsverarbeitungsschicht, die die Reaktionen der Sensorschicht vor der Signalerzeugung manipulieren kann (Abb. 1). Solche Informationsverarbeitungsschichten sind ein natürliches Merkmal von Organismen und ermöglichen es Zellen, Stressreaktionen zu aktivieren, die Entwicklung zu steuern und Verhaltensentscheidungen auf der Grundlage intrazellulärer und extrazellulärer Hinweise zu treffen8. Aus diesem Grund wurden genetische Informationsverarbeitungsschichten, die Logik und Feedback implementieren, in großem Umfang genutzt und in synthetischen Zellsystemen entwickelt9,10. In ähnlicher Weise haben wir zuvor gezeigt, dass RNA-basierte Schaltkreise zu einer zellfreien Biosensorplattform namens RNA Output Sensors Activated by Ligand INDuction (ROSALIND) hinzugefügt werden können, um ihre Spezifität und Empfindlichkeit zu verbessern, ohne die Proteinbiosensoren zu entwickeln7. Diese Schaltkreise wirken jedoch immer noch direkt auf die Sensor- oder die Ausgangsschicht, was unsere Möglichkeiten zur Verbesserung und Erweiterung ihrer Funktion einschränkt.

Hier entwickeln wir eine verallgemeinerbare Informationsverarbeitungsschicht, um die Funktion von ROSALIND zu verbessern und zu erweitern, indem wir die toehold-vermittelte DNA-Strangverdrängung (TMSD) nutzen – eine rechenleistungsstarke DNA-Nanotechnologie, die molekulare Informationen in vitro verarbeiten kann11. Bei TMSD tauschen einzelsträngige DNA-Eingänge (ssDNA) über komplementäre Basenpaarungswechselwirkungen Stränge mit doppelsträngigen DNA-„Toren“ aus, um ssDNA-Ausgangsstränge zu erzeugen. Durch die Konfiguration von DNA-Gattern in verschiedenen Netzwerkarchitekturen können eine Reihe von Vorgängen durchgeführt werden, wie z. B. Signalwiederherstellung12, Signalverstärkung13 und Logikberechnungen14,15, ähnlich wie bei einer allgemeinen chemischen Rechenarchitektur16. Die gut charakterisierte Thermodynamik der DNA-Basenpaarung ermöglicht den Aufbau großer Netzwerke aus einfachen Bausteinen. Darüber hinaus kann die Reaktionskinetik präzise abgestimmt werden, indem die Stärke der „Zehengriffe“ verändert wird – einzelsträngige Regionen innerhalb der DNA-Tore, die den Strangverdrängungsprozess einleiten17. TMSD hat zur Entwicklung leistungsstarker Geräte geführt, darunter In-vitro-Oszillatoren18, katalytische Verstärker19, autonome molekulare Motoren20,21 und umprogrammierbare DNA-Nanostrukturen22,23. Daher besteht ein großes Potenzial für die TMSD-basierte Informationsverarbeitung zur Verbesserung zellfreier Biosensoren.

Obwohl TMSD-Schaltkreise zum Nachweis von Nukleinsäurezielen wie microRNAs24,25 und menschlichen Krankheitserregern26 verwendet wurden, gibt es derzeit keine allgemeinen Designregeln für die Auslösung von TMSD-Schaltkreisen mit kleinen Molekülen, um deren Verwendung in zellfreien Biosensoren zu ermöglichen. Wir wollten daher eine Schnittstelle schaffen, die das Bindungsereignis eines chemischen Ziels in Veränderungen in Nukleinsäuresträngen umwandeln kann, die TMSD-Kaskaden auslösen können. Allosterische Transkriptionsfaktoren (aTFs) erzeugen diese Schnittstelle auf natürliche Weise, indem sie beim Nachweis eines chemischen Ziels die Transkription einer programmierbaren RNA-Sequenz aktivieren. Es gibt jedoch erhebliche Herausforderungen bei der Kombination von aTFs und TMSD-Schaltkreisen, um in situ zusammenzuarbeiten, wie z. B. Interferenzen zwischen RNA-Polymerase (RNAP) und Nukleinsäure-Gattern27, das Fehlen einer experimentellen Charakterisierung von RNA-vermittelten TMSD-Schaltkreisen28 und die Komplexität der Behinderung der RNA-Faltung Funktion der TMSD-Schaltung.

Hier gehen wir diese Herausforderungen an, indem wir Designregeln entwickeln, um die Sensorschichten von ROSALIND7 mit TMSD-Schaltkreisen zu verbinden. Wir zeigen zunächst, dass das Design eines neuen DNA-Signalgatters optimiert werden kann, um T7-RNAP-gesteuerte In-vitro-Transkription (IVT) und TMSD innerhalb derselben Reaktion zu ermöglichen. Als nächstes entwickeln wir die Entwurfsregeln für die RNA-Sekundärstruktur, um die Reaktionskinetik von TMSD abzustimmen und insbesondere die Reaktionsgeschwindigkeit zu verbessern. Wir wenden dieses Prinzip auch an, um TMSD mit mehreren verschiedenen aTFs zu verbinden, um Biosensoren für ihre zugehörigen Liganden zu erstellen. Anschließend demonstrieren wir die Programmierbarkeit der Plattform, indem wir 12 verschiedene Schaltkreise bauen, die sieben verschiedene Logikfunktionen implementieren (NOT, OR, AND, NOR, IMPLY, NIMPLY, NAND). Schließlich bauen wir mithilfe eines modellgesteuerten Ansatzes eine mehrschichtige TMSD-Schaltung auf, die wie ein Analog-Digital-Wandler (ADC) fungiert und eine Reihe binärer Ausgänge erzeugt, die den Konzentrationsbereich des Zielmoleküls kodieren. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass TMSD zur Implementierung molekularer Berechnungen verwendet werden kann, um die Fähigkeiten zellfreier Biosensoren zu erweitern.

Um ROSALIND mit TMSD zu verbinden, versuchten wir zunächst zu validieren, dass eine einzelsträngige RNA ein DNA-Signaltor strangverdrängen kann. Wir haben ein DNA-Signalgatter aus einer früheren Arbeit modifiziert, um ein Gatter mit einem Haltegriff aus acht Nukleotiden am 3′-Ende zu schaffen, wobei ein Strang mit einem Fluorophor und der andere Strang mit einem Quencher markiert ist (Supplementary Data 1)29. Anschließend haben wir einen eindringenden RNA-Strang (InvadeR) so entworfen, dass er vollständig komplementär zum Fluorophor-Strang ist, sodass er den Quencher-Strang strangverdrängt, um eine fluoreszierende Ausgabe zu erzeugen. Als wir gereinigtes InvadeR mit dem DNA-Signal-Gate kombinierten, beobachteten wir eine Fluoreszenzaktivierung bei einer Kontrolle ohne InvadeR (Ergänzende Abbildungen 1 und 2a). Auf diese Weise verhielt sich InvadeR ähnlich wie ein eindringender ssDNA-Strang (InvadeD), obwohl die Titration von InvadeR bei niedrigeren Konzentrationen zu einem Fluoreszenzplateau führte als InvadeD (ergänzende Abbildung 2a, b). Insbesondere sagt NUPACK30 voraus, dass InvadeD eine weniger stabile Struktur als InvadeR aufweist und dass InvadeR an sich selbst binden kann, um einen Duplex zu bilden, was die Funktion von InvadeR beeinträchtigen könnte (Ergänzende Abbildungen 2c – e, Ergänzende Daten 2 und 3).

Als nächstes stellten wir fest, ob InvadeR in situ in Gegenwart des DNA-Signaltors transkribiert werden kann, um ein Signal zu erzeugen. Dem Design der ROSALIND-Plattform folgend, wählten wir eine schnelle, prozessive Phagenpolymerase, T7 RNAP, und konfigurierten die DNA-Matrize so, dass sie aus der minimalen T7-Promotorsequenz mit 17 Basenpaaren (bp), gefolgt von zwei initiierenden Guaninen und der InvadeR-Sequenz (Supplementary Data) besteht 1). Wir beobachteten zunächst, dass T7-RNAP allein vom DNA-Signaltor ein Fluoreszenzsignal erzeugen konnte (Extended Data, Abb. 1b). Auf der Grundlage früherer Berichte 27, 31, 32, 33 stellten wir die Hypothese auf, dass T7-RNAP die Transkription aus der 3′-Toehold-Region des DNA-Signaltors initiiert, was zu einer Strangverschiebung und Signalerzeugung führt (Extended Data, Abb. 1a). Um diese Hypothese zu testen, haben wir die Polarität des DNA-Signaltors umgekehrt, um ein 5'-Toehold-Ende einzubeziehen, und kein Fluoreszenzsignal vom 5'-Toehold-DNA-Signaltor beobachtet (Extended Data, Abb. 1b). Die Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Harnstoff-PAGE)-Analyse der RNA-Spezies aus jeder IVT-Reaktion zeigte auch RNA-Nebenprodukte nur aus der Reaktion mit dem 3'-Toehold-DNA-Signalgatter (Extended Data, Abb. 1c). Wir haben bestätigt, dass die 2′-O-Methylierung des DNA-Signalgatters33 die falsche Transkription ebenfalls eliminiert (Extended Data Abb. 1d – f).

Mit dem optimierten DNA-Signal-Gate-Design verwendeten wir als nächstes TMSD, um die durch T7-RNAP-gesteuerte IVT in situ erzeugten RNA-Ausgaben zu verfolgen. Wir haben uns darauf konzentriert, das Design von InvadeR für eine schnelle Signalerzeugung zu optimieren. Auf der Grundlage der Ergebnisse in der ergänzenden Abbildung 2 stellten wir die Hypothese auf, dass die Sekundärstruktur von InvadeR eine entscheidende Rolle für die TMSD-Effizienz spielen würde, beispielsweise durch Beeinträchtigung der Zehenbindung und Stranginvasion 34, 35. Um diese Hypothese zu testen, haben wir fünf verschiedene Varianten von InvadeR entworfen, jede mit unterschiedlichen vorhergesagten Stabilitäten und Sekundärstrukturen am 3′-Ende (Abb. 2a). Als eine äquimolare Menge jeder gelgereinigten InvadeR-Variante zum DNA-Signaltor hinzugefügt wurde, beobachteten wir, dass die Stärken der Fluoreszenzsignale entsprechend den vorhergesagten minimalen freien Energien jeder Variante geordnet waren (Abb. 2b). Darüber hinaus zeigte jede verstärkte Version eine wesentlich geringere Fluoreszenz als die entsprechende nicht verstärkte Variante.

a: Es wurden drei verschiedene Varianten von InvadeR entworfen. Variante 1 umfasst die beiden initiierenden Guanine, gefolgt von der Sequenz, die vollständig zum Fluorophorstrang komplementär ist. Bei den Varianten 2 und 3 wurden zwei oder drei zusätzliche Nukleotide zwischen den initiierenden Guaninen und der InvadeR-Sequenz (schattierte Regionen) eingefügt, sodass sie die Sekundärstruktur an ihrer Basis zerstören. Es wurden verstärkte Versionen der Varianten 2 und 3 erstellt, um die Struktur zu stabilisieren und gleichzeitig die Anzahl und Positionen der eingefügten Nukleotide konsistent zu halten. Alle Varianten haben die gleiche Anzahl an Nukleotiden, die mit dem DNA-Signaltor interagieren. Minimale freie Energien und Basenpaarungswahrscheinlichkeiten für jede Struktur werden mit NUPACK bei 37 °C30 vorhergesagt. nts, ​​Nukleotide. b: Gelgereinigte InvadeR-Varianten (5 µM) wurden zu einer äquimolaren Menge des DNA-Signaltors hinzugefügt und die Fluoreszenzaktivierung wurde quantifiziert. Variante 3 erzeugt das höchste Fluoreszenzsignal, gefolgt von den Varianten 2 und 1, wohingegen beide verstärkenden Mutanten eine Signalabnahme ihrer jeweiligen Varianten um die über den Balken angegebene fache Reduktion zeigen. c: Wenn eine DNA-Matrize, die für InvadeR kodiert, in T7-RNAP und dem DNA-Signal-Gate enthalten ist, kann die RNA-Ausgabe in situ durch Überwachung der Fluoreszenzaktivierung vom Signal-Gate verfolgt werden. d, Vergleich der Fluoreszenzkinetik der drei Varianten von IVT unter Verwendung einer äquimolaren DNA-Matrize (50 nM) oder einer Negativkontrolle ohne Matrize. e,f: Ein Vergleich der Fluoreszenzkinetik zwischen Varianten und ihren verstärkenden Mutanten für Variante 2 (e) und Variante 3 (f) zeigt, dass sich verstärkende Basenpaare negativ auf die Fluoreszenzkinetik auswirken. Bei allen gezeigten Daten handelt es sich um n = 3 unabhängige biologische Replikate, die jeweils als Punkt (b) oder Linie (d–f) mit auf MEF (µM Fluorescein) standardisierter Rohfluoreszenz aufgetragen sind. Jede Balkenhöhe in b stellt den Durchschnitt dieser Replikate dar. Fehlerbalken (b) und Schattierungen (d–f) geben den Durchschnitt der Replikate ± Standardabweichung an

Quelldaten

Anschließend haben wir die TMSD-Reaktionskinetik der in situ transkribierten Varianten getestet. Als 50 nM der für jede InvadeR-Variante kodierenden DNA-Matrize dem IVT-Reaktionsgemisch zugesetzt wurden (Abb. 2c), beobachteten wir in Übereinstimmung mit dem Vorhergehenden die schnellste Fluoreszenzaktivierung bei Variante 3, gefolgt von den Varianten 2 und 1 (Abb. 2d). Experiment. Wir beobachteten auch langsamere Reaktionen der verstärkten Versionen, was unsere Hypothese bestätigte (Abb. 2e, f).

Wir beobachteten jedoch Diskrepanzen zwischen den quantitativ vorhergesagten Sekundärstrukturstabilitäten und der Reaktionskinetik. Insbesondere zeigen die verstärkten Varianten mit niedrigeren Mindestwerten der freien Energie eine schnellere Reaktionskinetik und höhere Endpunktfluoreszenzwerte als Variante 1 (Abb. 2d – f), was im Widerspruch zu den in Abb. 2b beobachteten Ergebnissen steht. Wir haben herausgefunden, dass die Variation der T7-RNAP-Transkriptionseffizienz jeder DNA-Matrize36 zu dieser Diskrepanz beiträgt, obwohl die RNA-Sekundärstruktur einen größeren Einfluss auf die TMSD-Reaktionsgeschwindigkeit hat (Extended Data, Abb. 2). Wir fanden auch heraus, dass das Hinzufügen einer T7-Terminatorsequenz am Ende der DNA-Matrize die Reaktion beschleunigt, wenn auch nicht wesentlich (Ergänzende Abbildung 3 und Ergänzende Daten 3).

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Einbeziehung von Überlegungen zur Sekundärstruktur und zur Transkriptionseffizienz in die Designprinzipien von InvadeR genutzt werden kann, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen.

Als nächstes haben wir festgestellt, ob die Transkription von InvadeR mit einem aTF reguliert werden kann, um einen zellfreien Biosensor zu schaffen, der TMSD-Ausgänge nutzt. Dazu mussten wir eine aTF-Operatorsequenz zwischen den T7-Promotor und die InvadeR-Sequenz einfügen, um die Regulierung der aTF-Transkription zu ermöglichen. Wir haben zuvor gezeigt, dass der Abstand zwischen der T7-Promotorsequenz und der aTF-Operatorsequenz für eine effiziente Regulierung der IVT in ROSALIND-Reaktionen wichtig ist7,37. In ähnlicher Weise haben wir herausgefunden, dass ein 2-bp-Spacer ein robustes TMSD-Signal ohne TetR erzeugt, das bei Regulierung durch TetR auf nahezu das Ausgangsniveau reduziert wurde (Abb. 3a, b).

a: IVTs können allosterisch mit einer Matrize reguliert werden, die so konfiguriert ist, dass sie einen gereinigten aTF (TetR) über eine Operatorsequenz (tetO) bindet, die stromabwärts des T7-Promotors platziert ist. Eine Reihe von Spacern in Abständen von 2 bp wurde konstruiert, um den Einfluss der Spacerlänge auf die Fähigkeit von TetR, die Transkription von InvadeR zu regulieren, zu bewerten. b: Endpunktdaten (nach 1 Stunde) für regulierte (mit 5 μM TetR-Dimer, 50 nM DNA-Matrize) und unregulierte (ohne TetR) Promotor-Operator-Spacer-Varianten. c: Die Induktion einer TetR-regulierten IVT-Reaktion erfolgt in Gegenwart des zugehörigen Liganden aTc, der an TetR bindet und dessen Bindung an tetO verhindert. Dadurch kann die Transkription fortgesetzt werden, was zur Fluoreszenzaktivierung über TMSD führt. d, Dosisreaktion mit aTc, gemessen nach 1 Stunde mit 50 nM DNA-Matrize und 5 μM TetR-Dimer. Die niedrigste Ligandenkonzentration, bei der das Signal vom Hintergrund unterscheidbar ist, wurde mithilfe eines zweiseitigen, heteroskedastischen Student-t-Tests gegen die Bedingung ohne Liganden bestimmt. Der P-Wertebereich ist durch Sternchen gekennzeichnet (***P < 0,001, **P = 0,001–0,01, *P = 0,01–0,05, der genaue P-Wert für 5 µM aTc = 5,064 × 10−5). Genaue P-Werte sowie Freiheitsgrade für alle getesteten Ligandenkonzentrationen finden Sie in den Quelldaten. Daten für den Zustand ohne Liganden wurden ausgeschlossen, da die x-Achse auf der logarithmischen Skala liegt und in den Quelldaten dargestellt wird. e, die Geschwindigkeit der TMSD-Ausgabe ist schneller als die der RNA-Aptamer-Ausgabe. f, Vergleich der Fluoreszenzkinetik zwischen den TetR-regulierten InvadeR- und Aptamer-Ausgängen bei Induktion mit 10 μM aTc. Bei allen gezeigten Daten handelt es sich um n = 3 unabhängige biologische Replikate, die jeweils als Punkt (b, d) oder Linie (f) mit rohen Fluoreszenzwerten, standardisiert auf MEF (μM Fluorescein), aufgetragen sind. Fehlerbalken (d) und Schattierung (f) geben den Durchschnitt der Replikate ± Standardabweichung an

Quelldaten

Mithilfe des 2-bp-Spacers haben wir als nächstes bestimmt, ob TetR mit seinem verwandten Liganden Anhydrotetracyclin (aTc) deprimiert werden kann, um die Transkription von InvadeR zu ermöglichen (Abb. 3c). Als eine Reihe von aTc-Konzentrationen zu IVT-Reaktionen hinzugefügt wurden, die jeweils 50 nM DNA-Matrize, 5 µM TetR-Dimer und 5 µM DNA-Signal-Gate enthielten, beobachteten wir eine starke Repression bis hin zu niedrigen mikromolaren Mengen an aTc mit einer halbmaximalen Induktion zwischen 2,5 und 5 µM aTc (Abb. 3d).

Aufgrund der hohen Geschwindigkeit von TMSD-Reaktionen17 gingen wir davon aus, dass die ligandenvermittelte Induktionsgeschwindigkeit des InvadeR-Ausgangs viel schneller sein würde als der zuvor verwendete ROSALIND-RNA-Aptamer-Ausgang, der einer langsamen Chromophorbindung und Fehlfaltung unterliegt34,38,39 (Abb. 3e). Wie erwartet haben wir beobachtet, dass die InvadeR-Plattform die sichtbare Fluoreszenz in etwa 10 Minuten aktiviert, was etwa fünfmal schneller ist als die RNA-Aptamer-Plattform (Abb. 3f).

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass ein aTF-basierter Biosensor erfolgreich mit TMSD-Ausgängen verbunden werden kann, was zu sofortigen Verbesserungen der Reaktionsgeschwindigkeit führt.

Als nächstes haben wir festgestellt, ob das System mit verschiedenen Familien von aTFs kompatibel ist, um verschiedene Klassen kleiner Moleküle zu erkennen. Zusätzlich zu TetR haben wir TtgR40 und SmtB41 als repräsentative aTFs der MarR-Familie42 bzw. SmtB/ArsR-Familie43 ausgewählt. Wir haben die verwandte Operatorsequenz jedes aTF 2 bp stromabwärts des T7-Promotors und unmittelbar stromaufwärts der InvadeR-Sequenzen platziert (Extended Data Abb. 3a – c). Als Tetracyclin zur Auslösung TetR-regulierter Reaktionen verwendet wurde, beobachteten wir ein starkes und robustes Fluoreszenzsignal, das in ca. 10 Minuten sichtbar war (Extended Data Abb. 3d, g). Als Naringenin, ein verwandter Ligand von TtgR, zu TtgR-regulierten Reaktionen hinzugefügt wurde, sahen wir in ähnlicher Weise erneut eine robuste Fluoreszenzaktivierung nur in Gegenwart von Naringenin (Extended Data Abb. 3e, h). Die Einführung der smtO-Sequenz führte jedoch selbst bei unregulierten Reaktionen zu viel langsameren Reaktionsgeschwindigkeiten (Extended Data Abb. 4c). Interessanterweise wird vorhergesagt, dass die smtO-Sequenz mit der InvadeR-Sequenz eine starke Haarnadel bildet (Extended Data Abb. 4a), was sich auf der Grundlage unserer Ergebnisse in Abb. 2 auf die Reaktionsgeschwindigkeit auswirken könnte. Um die Reaktionskinetik zu verbessern, haben wir ein RNA-Strukturisolationsmodul entwickelt, um die intramolekulare smtO:InvadeR-Faltung zu verhindern (Extended Data Abb. 4), das eine schnellere Signalaktivierung einer SmtB-regulierten Reaktion in Gegenwart von ZnSO4 mit niedrigem Hintergrundsignal zeigte ( Erweiterte Daten Abb. 3f,i).

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass RNA-Designstrategien verwendet werden können, um die ROSALIND-Plattform modular um TMSD-Schaltkreise zu erweitern.

Die Schnittstelle zellfreier Biosensoren mit TMSD bietet Möglichkeiten zur Entwicklung modularer Geräte, die programmierte Aufgaben als Reaktion auf Eingaben kleiner Moleküle ausführen können. Dies gilt insbesondere, weil für TMSD-Schaltkreise einfachere Designregeln gelten als für Proteinschaltkreise44, es Rechenmodelle gibt, die ihr Verhalten genau vorhersagen34,35 und es eine neue Reihe von TMSD-Schaltkreisdesign-Tools45,46 gibt. Wir haben diese Funktionen daher genutzt, um eine TMSD-Informationsverarbeitungsschicht für ROSALIND zu erstellen.

Wir haben zunächst Logikgatter entworfen und gebaut, um zwei verschiedene Liganden als Eingaben für das System zu verarbeiten. Insbesondere haben wir frühere Designs von TMSD-Logikgattern AND und OR angepasst, die Nukleinsäureeingaben erkennen12,14,15,46 (Abb. 4). Wir haben die OR-Logik implementiert, indem wir DNA-OR-Gatter entworfen haben, die als Zwischenschicht zwischen InvadeR und dem Signalgatter fungieren. Sobald die Transkription von InvadeR durch einen chemischen Liganden ausgelöst wird, führt InvadeR TMSD an seinem entsprechenden DNA-OR-Gate durch, um einen ssDNA-Ausgangsstrang freizusetzen, der anschließend in das DNA-Signalgatter eindringen kann, um ein Signal zu erzeugen (Abb. 4a und ergänzende Daten 4)46 . Die beiden DNA-OR-Gatter teilen sich die gleiche Ausgangsdomäne (grün), werden jedoch durch InvadeR aktiviert, das durch zwei verschiedene aTFs reguliert wird. Die Einbeziehung dieser OR-Gatter neben DNA-Vorlagen, aTFs und dem Signalgatter führte zu einer schnellen Signalerzeugung, außer wenn keine Zielliganden vorhanden waren (Abb. 4b und ergänzende Daten 5). Die Modellierung des OR-Gatters unter Verwendung eines Satzes gewöhnlicher Differentialgleichungen (ODEs), die die IVT- und TMSD-Reaktionen beschreiben (Einzelheiten zum verwendeten ODE-Modell finden Sie in den Zusatzinformationen), stimmte mit den experimentellen Trends überein (Erweiterte Daten, Abb. 5a und Zusatzdaten 6).

a: Ein ODER-Gatter mit zwei Eingängen umfasst zwei zusätzliche DNA-OR-Gatter. Wenn die Transkription durch einen der Liganden aktiviert wird, können InvadeR-Stränge mit ihren jeweiligen DNA-OR-Gattern reagieren und einen Ausgangsstrang mit einer Domäne (grün) erzeugen, die in das DNA-Signalgatter eindringen kann. b: Wenn das OR-Gate mit zwei Eingängen entweder durch Tetracyclin, ZnSO4 oder beides aktiviert wird, wird eine Fluoreszenzaktivierung beobachtet. c: Ein UND-Gatter mit zwei Eingängen enthält ein DNA-UND-Gatter, das erfordert, dass beide InvadeR-Stränge den Ausgangsstrang dissoziieren, um den zum Signalgatter komplementären Haltegriff freizulegen. Designmerkmale wie thermodynamische Treiber (rot hervorgehoben) und eine Klemmdomäne werden implementiert, um eine effiziente TMSD mit minimalem Leck zu ermöglichen (Erweiterte Daten, Abb. 6). d, Das UND-Gatter mit zwei Eingängen aktiviert die Fluoreszenz nur, wenn sowohl Tetracyclin als auch ZnSO4 vorhanden sind. e, ein NOT-Gate enthält zwei DNA-Templates: ein unreguliertes InvadeR-Template und ein aTF-reguliertes Inverter-Template. Bei der Transkription bildet der aTF-regulierte Inverter eine Haarnadelstruktur, die dem DNA-Signalgatter ähnelt, um ein RNA-NOT-Gate zu erzeugen. Unreguliertes InvadeR reagiert vorzugsweise mit dem RNA-NOT-Gate, da es eine größere Anzahl von Basenpaar-Wechselwirkungen und eine Basenpaar-Fehlpaarung mit dem DNA-Signal-Gate (rot) gibt. Eine Spacer-Sequenz ist enthalten, um zu verhindern, dass die tetO-Sequenz das RNA-NOT-Gate stört. f: Bei Implementierung mit einem Tetracyclin-Sensor erzeugt das NOT-Gate ein Signal in Abwesenheit von Tetracyclin. Bei allen gezeigten Daten handelt es sich um n = 3 unabhängige biologische Replikate, die jeweils als Linie mit einem auf MEF (μM Fluorescein) standardisierten Rohfluoreszenzwert dargestellt sind. Die Schattierung gibt den Durchschnitt der Replikate ± SD an. Domänen mit derselben Farbe haben dieselbe Sequenz, mit Ausnahme des UND-Gatters, bei dem die orange hervorgehobene Domäne gegenüber der orangefarbenen Domäne im ODER-Gatter geändert wird, um ihre TMSD-Effizienz zu verbessern. Alle Nukleinsäure-Gates werden gemäß den mit NUPACK vorhergesagten Sekundärstrukturen bei 37 °C30 gezeichnet. Die Reihenfolge jeder Domäne und die Konzentrationen der Komponenten in jedem Tor finden Sie in den Zusatzdaten 4 bzw. 5.

Quelldaten

Als nächstes haben wir ein RNA-basiertes TMSD-AND-Gatter entworfen, indem wir ein früheres AND-Gatter-Design47 angepasst haben, das aus drei Domänen besteht: Domäne 1 komplementär zu InvadeR 1 (blau), Domäne 2 komplementär zu InvadeR 2 (orange) und Domäne 3 komplementär zur DNA Signaltor (grün) (Abb. 4c und ergänzende Daten 5). InvadeR-Stränge wurden so konzipiert, dass sie unterschiedliche Toehold-Sequenzen aufweisen, um unerwünschte Toehold-Bindungen an die falsche AND-Gate-Domäne zu minimieren. Die Implementierung dieser Architektur in Sensorreaktionen mit TetR und SmtB führte zunächst unter keinen Umständen zu einer Fluoreszenzaktivierung (Extended Data Abb. 6b). Um TMSD-Reaktionen voranzutreiben, haben wir Fehlpaarungen in das UND-Gatter eingebaut, die als thermodynamische TMSD-Treiber 48 fungieren (Extended Data Abb. 6a). Obwohl die thermodynamischen Treiber eine Signalaktivierung durch InvadeR zeigten, wurde unter der Nur-InvadeR-1-Bedingung ein erhebliches Leck beobachtet (Erweiterte Daten, Abb. 6c). Um dieses Leck zu reduzieren, haben wir eine zusätzliche Designfunktion namens „Clamp“ in Domäne 3 des UND-Gatters implementiert, die eine teilweise TMSD nur bei Vorhandensein von InvadeR 1 verhindert49. Durch Erhöhen der Klemmenlänge auf 7 bp haben wir ein UND-Gatter gebaut, das sowohl Tetracyclin- als auch ZnSO4-induzierbare InvadeR-Stränge zur Signalerzeugung benötigt (Abb. 4d, erweiterte Daten Abb. 5b und 6e und ergänzende Daten 5).

Der Aufbau komplexerer Logikgatter über AND und OR hinaus erfordert einen NOT-Schaltkreis, der das Signal in Gegenwart eines Zielliganden blockiert. Um eine Signalinversion zu erreichen, haben wir ein RNA-NOT-Gate entwickelt, das InvadeR vom DNA-Signalgatter abtrennen kann (Abb. 4e und ergänzende Daten 4)47,50. Um die InvadeR-Bindung an das RNA-NOT-Gate zu beeinflussen, haben wir drei Designmerkmale integriert: (1) einen längeren Halt am RNA-NOT-Gate als am DNA-Signal-Gate; (2) zusätzliche Basenpaarung in der Schleife des RNA-NOT-Gatters; und (3) eine Nichtübereinstimmung (rot hervorgehoben) zwischen InvadeR und dem DNA-Signaltor (Extended Data Abb. 6f – j). Wir haben außerdem eine Spacer-Sequenz zwischen dem RNA-NOT-Gate und dem tetO-Operator entworfen, um die tetO-Sequenz strukturell von der NOT-Gate-Sequenz zu isolieren (Abb. 4e). Bei der Implementierung dieser Designmerkmale beobachteten wir eine Signalreduzierung in Gegenwart von Tetracyclin (Abb. 4f, erweiterte Daten, Abb. 5c und ergänzende Daten 5). Bei einer Kontrollvorlage, deren Sequenz aus dem Tetracyclin-induzierbaren RNA-NOT-Gate gemischt wurde, wurde keine Signalinversion beobachtet (Extended Data Abb. 7a, b). Die gleiche Designarchitektur wurde angewendet, um ein ZnSO4-induzierbares RNA-NOT-Gate zu bauen (Extended Data Abb. 5d, 6k–m und 7c,d sowie Supplementary Data 4 und 5).

Diese Ergebnisse legen eine Reihe von Entwurfsregeln für den Aufbau kaskadierter TMSD-Schaltungen für komplexere Logikgatterberechnungen fest.

Als nächstes haben wir die grundlegenden Logikkomponenten geschichtet, um komplexe Logikberechnungen durchzuführen, einschließlich NOR, NAND, IMPLY und NIMPLY.

Wir begannen mit NOR – einer Umkehrung des ODER-Gatters, das nur dann ein Signal erzeugt, wenn alle Eingaben fehlen –, indem wir zwei RNA-NICHT-Gatter kombinierten, die jeweils durch TetR oder SmtB reguliert wurden (Abb. 5a und ergänzende Daten 4). Da beide RNA-NOT-Gates so konzipiert sind, dass sie das gleiche konstitutiv exprimierte InvadeR binden, beobachteten wir eine Fluoreszenzaktivierung nur in Abwesenheit beider Ligandeneingaben (Abb. 5b, erweiterte Daten, Abb. 5e und ergänzende Daten 5).

a: Ein NOR-Gatter mit zwei Eingängen wird durch Übereinanderschichten von zwei RNA-NICHT-Gattern aufgebaut. Die NOT-Gatter werden entweder durch TetR oder SmtB reguliert, die die unregulierten InvadeR-Moleküle vom DNA-Signalgatter absondern. b: Fluoreszenzaktivierung wird nur in Abwesenheit beider Eingaben beobachtet. c: Ein IMPLY-Gatter mit zwei Eingängen kombiniert ein DNA-OR-Gatter mit einem RNA-NICHT-Gatter. In diesem speziellen Beispiel (ZnSO4 IMPLY Tetracyclin) wird das OR-Gate durch TetR und das NOT-Gate durch SmtB reguliert, wodurch die Signalerzeugung nur in Gegenwart von ZnSO4 verhindert wird. d, Fluoreszenzaktivierung wird beobachtet, sofern nicht nur ZnSO4 hinzugefügt wird. Eine schnellere Signalerzeugung wird im Nur-Tetracyclin-Eingangszustand beobachtet, da zwischen dem OR-Gate-Ausgangsstrang und dem Signal-Gate keine Diskrepanz besteht. e: Ein NAND-Gatter mit zwei Eingängen überlagert zwei unregulierte DNA-ODER-Gatter mit zwei regulierten RNA-NICHT-Gattern. In dieser Konfiguration ist das Vorhandensein beider Eingänge erforderlich, um die Signalerzeugung zu verhindern. Thermodynamische Treiber (rot hervorgehoben) sind in die NOT-Gatter integriert, um die Wechselwirkungen mit ihren jeweiligen InvadeR-Strängen zu begünstigen. f, Die erwartete NAND-Gate-Berechnung wird beobachtet. g: Ein NIMPLY-Gatter mit zwei Eingängen wird durch die Kombination des DNA-UND-Gatters und des RNA-NICHT-Gatters erstellt. In diesem speziellen Beispiel sind Tetracyclin-induzierter InvadeR und unregulierter InvadeR für die UND-Gatter-Aktivierung erforderlich. Ein SmtB-reguliertes NOT-Gate sequestriert den unregulierten InvadeR. h, Fluoreszenzaktivierung wird nur in Gegenwart von Tetracyclin beobachtet. Bei allen gezeigten Daten handelt es sich um n = 3 unabhängige biologische Replikate, die jeweils als Linie mit einem auf MEF (μM Fluorescein) standardisierten Rohfluoreszenzwert dargestellt sind. Die Schattierung gibt den Durchschnitt der Replikate ± SD an. Domänen mit derselben Farbe haben dieselbe Sequenz, mit Ausnahme des UND-Gatters, bei dem die orange hervorgehobene Domäne gegenüber der orangefarbenen Domäne im ODER-Gatter geändert wird. Alle Nukleinsäure-Gates werden gemäß den mit NUPACK vorhergesagten Sekundärstrukturen bei 37 °C30 gezeichnet. Die Reihenfolge jeder Domäne und die Konzentrationen der Komponenten in jedem Tor finden Sie in den Zusatzdaten 4 bzw. 5.

Quelldaten

Als nächstes konzentrierten wir uns auf die A IMPLY B-Architektur, die das Signal nur blockiert, wenn A vorhanden und B nicht vorhanden ist. Das ZnSO4 IMPLY-Tetracyclin-Gate wurde durch Überschichten des Tetracyclin-induzierten DNA-OR-Gates mit dem ZnSO4-induzierten RNA-NOT-Gate aufgebaut (Abb. 5c und ergänzende Daten 4). Bei der Implementierung generierte das Gate unter allen Eingangsbedingungen ein Signal, außer wenn nur ZnSO4 vorhanden ist (Abb. 5d und erweiterte Daten Abb. 5f). Wir stellen jedoch fest, dass die eingebaute Nichtübereinstimmung zwischen InvadeR und dem Signal-Gate (rot hervorgehoben) zu einem langsameren und niedrigeren Fluoreszenzsignal bei der Bedingung „keine Eingabe“ oder „beider Eingabe“ führte als bei der Bedingung „nur Tetracyclin“, und ähnliche Effekte wurden beobachtet aus dem Tetracyclin-IMPLY-ZnSO4-Gate (Extended Data Abb. 5g und 7e,f). Interessanterweise können IMPLY-Gates auch ohne das DNA-OR-Gate gebaut werden, was direkte Wechselwirkungen zwischen dem Liganden-induzierten InvadeR-Strang und dem Signal-Gate ermöglicht (Extended Data Abb. 5h,i und 7g–j). Die Möglichkeit, alternative Gate-Architekturen für die gleiche Logikberechnung zu entwerfen, unterstreicht die Modularität der Plattform.

Anschließend haben wir ein NAND-Gatter konstruiert, das NICHT- und UND-Gatter kombiniert, um unter allen Bedingungen Signale zu erzeugen, außer wenn beide Eingänge vorhanden sind. Wir haben zwei Designoptionen untersucht: (1) Umkehrung eines UND-Gatter-Ausgangsstrangs (A NAND B = NOT (A AND B)); und (2) zwei RNA-NOT-Gatter, die in die OR-Gate-Architektur integriert sind (NOT (A AND B) = NOT A OR NOT B). Aufgrund der durch die erste Entwurfsoption auferlegten Sequenzbeschränkungen haben wir uns entschieden, das NAND-Gatter mit der zweiten Option zu bauen (Abb. 5e). Dieses Design umfasst vier verschiedene DNA-Templates – zwei unregulierte Templates, die jeweils InvadeR für das entsprechende DNA-OR-Gate kodieren, und zwei regulierte Templates, die jeweils das RNA-NOT-Gate kodieren, das in der Lage ist, sein jeweiliges InvadeR zu sequestrieren. Um die beim IMPLY-Gate-Design beobachtete langsamere TMSD-Reaktionskinetik zu vermeiden, haben wir stattdessen einen thermodynamischen Treiber in das RNA-NOT-Gate (rot hervorgehoben) eingeführt, um die TMSD von InvadeR mit dem RNA-NOT-Gate gegenüber der mit dem DNA-OR-Gate zu begünstigen (Abb. 5e). Bei der Implementierung waren sowohl Tetracyclin als auch ZnSO4 erforderlich, um die Signalerzeugung zu verhindern (Abb. 5f und erweiterte Daten. Abb. 5j).

Schließlich haben wir das A NIMPLY B-Gatter entworfen, das UND- und NICHT-Gatter kombiniert, um nur dann einen Ausgang zu erzeugen, wenn Eingang A allein vorhanden ist. Das in Abb. 5g gezeigte spezifische NIMPLY-Gate-Design verwendet das ZnSO4-induzierte RNA-NOT-Gate neben einem DNA-AND-Gate, das sowohl unreguliertes InvadeR als auch Tetracyclin-induziertes InvadeR zur Aktivierung erfordert. Sowohl das ZnSO4-NIMPLY-Tetracyclin-Gate als auch das Tetracyclin-NIMPLY-ZnSO4-Gate führten die erwarteten Logik-Gate-Berechnungen durch (Abb. 5h und Extended Data Abb. 5k, l und 7k).

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass grundlegende Logikgatterkomponenten geschichtet werden können, um komplexere molekulare Berechnungen unter Verwendung kleiner Moleküle als Eingaben für das System durchzuführen.

Um eine praktische Anwendung der TMSD-Informationsverarbeitung zu demonstrieren, konzentrierten wir uns als nächstes auf die Quantifizierung der Biosensor-Ausgaben. In typischen zellfreien Biosensorsystemen werden Ausgaben generiert, wenn die Konzentration der Eingangsverbindung über einem Nachweisschwellenwert liegt, wodurch eine Interpretation der „Anwesenheit/Abwesenheit“-Ergebnisse entsteht, die auf diesen Schwellenwert abgestimmt ist51. Diese Nachweisschwelle wird durch die aTF-Ligand- und aTF-DNA-Bindungskonstanten bestimmt, deren Abstimmung schwierig sein kann. Um dieser Einschränkung zu begegnen, haben wir ein System wie eine ADC-Schaltung52 entwickelt, um eine Reihe binärer Ausgänge zu erzeugen, die die analoge Eingangskonzentration der Zielverbindung kodieren (ergänzende Abbildung 4).

Um eine genetische ADC-Schaltung zu konstruieren, haben wir zunächst eine Komparatorschaltung erstellt – einen Baustein von ADCs, der einen „echten“ binären Ausgang erzeugt, wenn der Eingang über einem vordefinierten Schwellenwert liegt. Bei TMSD ist ein Schwellenwert möglich, da die Reaktionskinetik durch die Verlängerung der DNA-Gate-Toehold-Regionen präzise erhöht werden kann17 (Abb. 6a). Mithilfe dieser Funktion haben wir ein unmarkiertes DNA-Schwellenwert-Gate gebaut, das die gleiche Sequenz wie das DNA-Signal-Gate aufweist, jedoch über einen längeren Haltepunkt von acht Nukleotiden verfügt (Abb. 6a). Da das Signal erst aktiviert werden sollte, nachdem das Schwellenwert-Gate vollständig verbraucht ist, haben wir überlegt, dass wir durch die Abstimmung der Menge des Schwellenwert-Gates den Zeitpunkt genau steuern können, zu dem InvadeR die Fluoreszenz des Signal-Gates aktiviert. Die Modellierung dieses kinetischen Verhaltens zeigte, dass dies tatsächlich das vorhergesagte Verhalten des Aufbaus ist, und wir beobachteten experimentell eine quantitative Übereinstimmung mit den Modellvorhersagen (Abb. 6b). Auf diese Weise fungiert eine TMSD-Reaktion mit Schwellenwert als „kinetischer“ Komparatorschaltkreis – für einen gegebenen Eingang ist der Zeitpunkt, zu dem die Signalerzeugung erfolgt, proportional zum Betrag des Schwellenwert-Gatters.

a: Durch Erhöhen der Länge der DNA-Gate-Toehold-Region kann der Stranginvasionsprozess beschleunigt werden. Ein unmarkiertes DNA-Gate mit einem längeren Halt (acht Nukleotide) kann dann bevorzugt mit InvadeR reagieren und als programmierbarer Schwellenwert fungieren. InvadeR kann das Signal-Gate (Vier-Nukleotid-Toehold) nur dann strangverdrängen, wenn das Schwellen-Gate erschöpft ist. b: Die Titration des Acht-Nukleotid-Toehold-Schwellenwert-Gates in unterschiedlichen Verhältnissen über einer festen Signal-Gate-Konzentration (0–8×) führt zu einer Zeitverzögerung bei der Fluoreszenzaktivierung, die mit ODE-Simulationen quantitativ modelliert werden kann (gepunktete Linien). Alle Daten für n = 3 unabhängige biologische Replikate, jeweils als Linie dargestellt. Rohe Fluoreszenzwerte wurden zunächst auf MEF (μM Fluorescein) standardisiert und auf den maximalen MEF unter allen Bedingungen normalisiert, um ihren Vergleich mit den Simulationen zu ermöglichen (siehe Methoden für die verwendete Normalisierungsmethode). Die Schattierung zeigt den Durchschnitt der Replikate ± sd c an. Ein molekularer ADC-Schaltkreis wird durch die Konstruktion eines Teststreifens desselben Sensors hergestellt, wobei jeder Test eine andere Konzentration des DNA-Schwellenwert-Gates enthält. Eine höhere Schwellenwert-Gate-Konzentration erfordert eine höhere Ligandenkonzentration, um die Fluoreszenz zu aktivieren. Wenn auf jedes Röhrchen die gleiche Probe aufgetragen wird, kann ein Benutzer semiquantitative Informationen über die Konzentration des in der Probe vorhandenen Liganden erhalten (analoger Eingang), indem er die Reihe von Röhrchen identifiziert, die aktiviert werden (binärer digitaler Ausgang). Hier definieren wir eine Röhre mit einem MEF-Wert >0,5 als „EIN“, da der sichtbare Schwellenwert um den angegebenen Wert herum liegt. d,e, Charakterisierung eines molekularen ADC-Schaltkreises für Zink mithilfe von ODE-Simulationen (d) und experimentellen Endpunktdaten nach 100 Minuten (e), generiert mit dem SmtB-regulierten Zinksensor. Die Werte auf der Heatmap stellen den durchschnittlichen MEF (μM Fluorescein) von n = 3 unabhängigen biologischen Replikaten dar (siehe Erweiterte Daten Abb. 8 für alle Daten).

Quelldaten

Als nächstes haben wir eine Reihe von TMSD-Komparatorschaltkreisen für die Biosensorik erstellt, die als ADC für die Ligandenkonzentration fungieren, indem wir eine Reihe von Reaktionen vorbereitet haben, bei denen jedes Röhrchen eine unterschiedliche Menge des Schwellenwert-Gates enthält. Durch Zugabe der gleichen Ligandenkonzentration zu jedem Röhrchen kann ein Benutzer beobachten, welche Röhrchen in der Reihe zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiviert werden, und semiquantitative Informationen über die Ligandenkonzentration erhalten (Abb. 6c). Wir testeten die Machbarkeit des Ansatzes unter Verwendung desselben Satzes von ODEs, die in Abb. 6b verwendet wurden, unter Hinzufügung von aTF-DNA und aTF-Ligand-Bindungskinetik, wobei wir uns aufgrund seiner Relevanz für die kommunale Wasserversorgung auf die Zinkerkennung konzentrierten53. Mithilfe von Modellierungssimulationen haben wir die Schwellenwert-Gate-Konzentrationen ermittelt, die erforderlich sind, um ein, zwei, drei oder vier Röhren nach 100 Minuten zu aktivieren, entsprechend Zinkkonzentrationen von 2, 3,5, 5 bzw. 10 µM (Abb. 6d). Anschließend bauten wir den entsprechenden genetischen ADC-Schaltkreis mit den SmtB-regulierten TMSD-Reaktionen auf und sahen das erwartete Signalmuster nach 100 Minuten, wobei die Anzahl der aktivierten Röhren in der Reihe mit höheren zugeführten ZnSO4-Konzentrationen zunahm (Abb. 6e und Extended Data Abb. 8a–d). Diese Implementierung ermöglicht es einem Benutzer, den eingegebenen Zinkkonzentrationsbereich zu bestimmen, indem er die Reihenfolge der aktivierten Röhrchen direkt ausliest.

Wir glauben, dass diese Demonstration das Potenzial für TMSD-Schaltkreise darstellt, als Informationsverarbeitungsschicht zellfreier Biosensoren zu fungieren, die die Interpretation einfacher machen und den Informationsgehalt der Ausgangssignale erhöhen.

In dieser Studie zeigen wir, dass TMSD-Schaltkreise mit IVT verbunden werden können, um als Informationsverarbeitungsschicht für zellfreie Biosensoren zu fungieren. Die Geschwindigkeit der TMSD-Ausgänge führte zu einer erheblichen Steigerung der Signalerzeugungsgeschwindigkeit mit einer Erkennungszeit von weniger als 10 Minuten (Abb. 3f). Noch wichtiger ist, dass wir herausfanden, dass die einfache und definierte Natur von ROSALIND in Kombination mit der Rechenleistung von TMSD es uns ermöglichte, mehrere RNA-DNA-Gatter zu schichten, um 12 verschiedene Schaltkreise zu bauen, die sieben verschiedene Logikfunktionen modular implementieren (Abb. 4 und 5). Mithilfe dieser hohen Programmierbarkeit der Plattform haben wir auch einen Schaltkreis entworfen und validiert, der den Konzentrationsbereich einer unbekannten Zielverbindung in einer Probe abschätzen kann (Abb. 6). Schließlich ist diese Plattform für die Lyophilisierung geeignet (Extended Data Abb. 9) und kann mit unverarbeiteten Probenmatrizen aus der realen Welt verwendet werden (Extended Data Abb. 10).

Das System stellte eine Reihe von Designherausforderungen dar, darunter die Inkompatibilität von 3′-Toeholds in DNA-Gates mit T7-RNAP-gesteuerten IVT-Reaktionen (Extended Data Abb. 1)45, störende RNA-Sekundärstrukturen, die TMSD verlangsamen können (Abb. 2 und Extended Data Abb . 4) und unterschiedliche T7-Transkriptionseffizienz verschiedener DNA-Matrizen36 (Extended Data Abb. 2). Diese Herausforderungen boten die Möglichkeit, RNA-basierte TMSD-Designprinzipien zu entwickeln, von denen wir glauben, dass sie auf andere Nukleinsäure-Engineering-Systeme übertragbar sind (ergänzende Abbildung 5).

Eine der größten Einschränkungen der Plattform sind ihre Kosten. Chemisch modifizierte Oligos mit Reinigung können etwa 100 USD oder mehr kosten, obwohl mit einer einzigen Charge Hunderte von Reaktionen durchgeführt werden können. Darüber hinaus müssen DNA-Gates nach der Hybridisierung häufig gelgereinigt werden, um alle ungebundenen ssDNA-Stränge zu entfernen, was zeitintensiv und mühsam sein kann. Wir stellen jedoch fest, dass die Kosten für chemische Farbstoffe für fluoreszenzaktivierende RNA-Aptamer-Berichtssysteme nicht vernachlässigbar sind und die Vorteile des TMSD-Systems wie die verbesserte Reaktionsgeschwindigkeit und Rechenleistung seine Einschränkungen überwiegen.

Das Hauptmerkmal dieser Studie war der Nachweis des Potenzials von TMSD-Schaltkreisen, die Funktion zellfreier Biosensoren zu erweitern, indem sie als Informationsverarbeitungsschichten fungieren. Während kürzlich ein Ansatz entwickelt wurde, um aTF-basierte Biosensorik mit TMSD über Endonuklease-vermittelte TMSD-Kaskaden zu verbinden,54 wurde keine programmierbare molekulare Berechnung vorgestellt, die über die einfache Detektion von Kontaminanten hinausgeht. Zu Demonstrationszwecken haben wir mehrere geschichtete RNA-basierte TMSD-Schaltkreise modelliert, entworfen und validiert, die in der Lage sind, komplexe Logikgatterberechnungen mit Eingaben kleiner Moleküle durchzuführen, indem wir mehrere Elemente von DNA-basierten TMSD-Logikgattern angepasst haben (Abb. 4 und 5 und Erweiterte Daten-Abb . 5–7). Obwohl nicht gezeigt, könnten komplexere Logikschaltungen wie XOR und XNOR durch die Schichtung zusätzlicher Gatter entworfen werden.

Um die Fähigkeit der Plattform zur Informationsverarbeitung weiter hervorzuheben, haben wir einen genetischen ADC-Schaltkreis entwickelt, der zur Schätzung einer Eingangsligandenkonzentration auf semiquantitativer Ebene verwendet werden kann (Abb. 6). Insbesondere verwendet diese Schaltung eine Schwellenwertberechnung, um ein analoges Signal einer Eingangsmolekülkonzentration in ein digitales Ausgangssignal der Anzahl aktivierter Röhren umzuwandeln. Diese Entwicklung wurde durch die Möglichkeit ermöglicht, die Reaktionsraten von TMSD auf der Grundlage der Zehenlänge präzise abzustimmen. Wir weisen jedoch darauf hin, dass sich dieser genetische ADC-Schaltkreis von einem elektrischen ADC-Schaltkreis dadurch unterscheidet, dass sein Ergebnis vom Zeitpunkt der Aktivierung und nicht vom Aktivierungsniveau abhängt, da der Schaltkreis auf der Schwellenreaktionskinetik und nicht auf reinen Eingangskonzentrationen beruht. Daher eignet sich diese Strategie am besten zur Unterscheidung zwischen Ligandenkonzentrationen, die Unterschiede in der Ausgabekinetik verursachen (Extended Data Abb. 8e – g).

Wir glauben, dass diese Plattform die Tür zu anderen Arten der molekularen Berechnung in zellfreien Systemen öffnet. Beispielsweise könnte eine Verstärkungsschaltung wie eine katalytische Haarnadelanordnung55 auf ROSALIND mit TMSD angewendet werden, um Signale zu verstärken und einen Sensor ultraempfindlich zu machen. Über die Schwellenwertermittlung hinaus könnten andere in DNA-Wippe-Gate-Architekturen demonstrierte Operationen für verschiedene Berechnungen auf diese Plattform portiert werden46. Insbesondere können Logikgatter erweitert werden, um eine allgemeine Strategie zur Behebung der Promiskuität von aTF-Liganden7 zu entwickeln. Da praktisch jedes aTF verwendet werden kann, das in einem In-vitro-Kontext funktioniert7, könnten außerdem mehrere DNA-Gates mit unterschiedlichen Reportern zum Multiplexen hinzugefügt werden. Die grundlegende Rolle, die ADC-Schaltkreise bei der Verbindung analoger und digitaler elektronischer Schaltkreise spielen, verspricht auch die Übernahme zusätzlicher elektronischer Schaltkreisdesigns für biochemische Reaktionen.

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Einrichtung einer Schnittstelle zwischen der Biosensorik kleiner Moleküle und TMSD-Schaltkreisen ein vielversprechender erster Schritt zur Schaffung einer allgemeinen Plattform für molekulare Berechnungen ist, um die Funktion zellfreier Biosensortechnologien zu verbessern und zu erweitern.

Für die routinemäßige Klonierung wurde der Escherichia coli-Stamm K12 (NEB Turbo Competent E. coli, New England Biolabs, Katalog-Nr. C2984) verwendet. Für die rekombinante Proteinexpression wurde der E. coli-Stamm Rosetta 2(DE3)pLysS (Novagen, Katalog-Nr. 71401) verwendet. Als Wachstumsmedium wurde Luria-Brühe, ergänzt mit dem/den geeigneten Antibiotikum(en) (100 µg ml-1 Carbenicillin, 100 µg ml-1 Kanamycin und/oder 34 µg ml-1 Chloramphenicol), verwendet.

Die in dieser Studie verwendeten DNA-Signalgatter wurden durch integrierte DNA-Technologien als modifizierte Oligos synthetisiert. Sie wurden durch Denaturierung eines 6-Carboxyfluorescein (6-FAM)-modifizierten Oligonukleotids und des komplementären Iowa Black FQ Quencher-modifizierten Oligonukleotids (Supplementary Data 1) bei 95 °C getrennt für 3 Minuten und langsames Abkühlen (–0,1 °C s−1) erzeugt. auf Raumtemperatur in Annealing-Puffer (100 mM Kaliumacetat und 30 mM HEPES, pH 8,0) erhitzt. Die angelagerten Oligonukleotide wurden dann gereinigt, indem sie auf 20 % nativen PAGE-Tris-Borat-EDTA (TBE)-Gelen aufgelöst, die Bande der erwarteten Größe isoliert und über Nacht bei 4 °C in Anlagerungspuffer eluiert wurden. Das eluierte DNA-Gate wurde dann mit Ethanol präzipitiert, in hochreinem MilliQ-H2O resuspendiert und die Konzentration mit dem Thermo Scientific NanoDrop One Microvolume UV-Vis-Spektrophotometer quantifiziert. Die in den Abb. verwendeten DNA-Gates. 4–6 und erweiterte Daten Abb. 6 und 7 wurden mit der gleichen Methode hergestellt, jedoch durch Annealing zweier komplementärer Oligonukleotide ohne jegliche Modifikationen.

DNA-Oligonukleotide für die Klonierung und Sequenzierung wurden von Integrated DNA Technologies synthetisiert. Gene, die für aTFs kodieren, wurden entweder als gBlocks (Integrated DNA Technologies) oder als Genfragmente (Twist Bioscience) synthetisiert. Proteinexpressionsplasmide wurden unter Verwendung von Gibson Assembly (NEB Gibson Assembly Master Mix, New England Biolabs, Katalognummer E2611) in ein pET-28c-Plasmidrückgrat kloniert und waren so konzipiert, dass sie rekombinante Proteine ​​als C-terminale His-markierte Fusionen überexprimieren. Ein Konstrukt zur Expression von SmtB enthielt zusätzlich eine Erkennungssequenz zur Spaltung und Entfernung des His-Tags mithilfe der TEV-Protease. Gibson-assemblierte Konstrukte wurden in NEB-Turbo-Zellen transformiert und isolierte Kolonien wurden auf Plasmid-DNA gereinigt (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen, Katalog-Nr. 27106). Plasmidsequenzen wurden mit Sanger-DNA-Sequenzierung (Quintara Biosciences) unter Verwendung der in Supplementary Data 1 aufgeführten Primer verifiziert.

Alle Transkriptionsvorlagen wurden mit einer der beiden Methoden generiert: (1) PCR-Amplifikation (Phusion High-Fidelity PCR Kit, New England Biolabs, Katalog-Nr. E0553) eines Oligos, das einen T7-Promotor, eine optionale aTF-Operatorstelle usw. enthält InvadeR-Kodierungssequenz und ein optionaler T7-Terminator unter Verwendung der Primer-Sets; oder (2) Annealing von zwei komplementären Oligonukleotiden, die einen T7-Promotor, eine optionale aTF-Operatorstelle, die InvadeR- oder RNA-NOT-Gate-Kodierungssequenzen umfassen. Alle in dieser Studie verwendeten Oligos und Primersätze sind in den Zusatzdaten 1 aufgeführt. Hier definieren wir den T7-Promotor als minimale 17-bp-Sequenz (TAATACGACTCACTATA) mit Ausnahme des ersten transkribierten G. Die PCR-amplifizierten Templates wurden gereinigt (QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen, Katalog-Nr. 28106) und auf einem 2 % Tris-Acetat-EDTA-Agarose-Gel auf das Vorhandensein einer einzelnen DNA-Bande der erwarteten Größe überprüft. Die durch Annealing zweier komplementärer Oligos erzeugten Matrizen wurden mit der gleichen Methode wie unter „DNA-Gate-Vorbereitung“ beschrieben hergestellt und gereinigt. Die Konzentrationen aller DNA-Matrizen wurden mit dem Qubit dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen, Katalog-Nr. Q32853) bestimmt.

Alle Plasmide und DNA-Vorlagen wurden bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Eine Tabelle mit den Sequenzen und den Addgen-Zugangsnummern aller in dieser Studie generierten Plasmide und Oligos ist in den Zusatzdaten 1 aufgeführt.

InvadeR-Varianten, die für die gereinigten Oligo-Bindungstests verwendet wurden, wurden zunächst durch eine IVT über Nacht bei 37 °C aus einer Transkriptionsvorlage exprimiert, die ein cis-spaltendes Hepatitis-D-Ribozym am 3′-Ende der InvadeR-Sequenz mit den folgenden Komponenten kodiert: IVT-Puffer ( 40 mM Tris-HCl pH 8, 8 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 20 mM NaCl und 2 mM Spermidin), 11,4 mM NTPs pH 7,5, 0,3 Einheiten (U) thermostabile anorganische Pyrophosphatase (New England Biolabs, Katalog-Nr. M0296S) , 100 nM Transkriptionstemplate, 50 ng T7 RNAP und MilliQ hochreines H2O auf ein Gesamtvolumen von 500 µl. Die IVT-Reaktionen über Nacht wurden dann mit Ethanol gefällt und gereinigt, indem sie auf einem 20 % Harnstoff-PAGE-TBE-Gel aufgelöst, die Bande der erwarteten Größe (26–29 Nukleotide) isoliert und über Nacht bei 4 °C in hochreinem MilliQ-H2O eluiert wurden. Die eluierten InvadeR-Varianten wurden mit Ethanol gefällt, in hochreinem MilliQ-H2O resuspendiert, mit dem Qubit RNA BR Assay Kit (Invitrogen, Katalog-Nr. Q10211) quantifiziert und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert. Die verwendete Hepatitis-D-Ribozymsequenz ist in den Zusatzdaten 1 zu finden.

aTFs wurden wie zuvor beschrieben ausgedrückt und gereinigt7. Kurz gesagt, sequenzverifizierte pET-28c-Plasmide wurden in den E. coli-Stamm Rosetta 2(DE3)pLysS transformiert. Zellkulturen (1–2 l) wurden in Luria-Brühe bei 37 °C gezüchtet, mit 0,5 mM Isopropyl-β-d-thiogalactosid bei einer optischen Dichte (600 nm) von ~0,5 induziert und weitere 4 Stunden bei 37 °C gezüchtet °C. Anschließend wurden die Kulturen durch Zentrifugieren pelletiert und entweder bei –80 °C gelagert oder in Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) und Proteaseinhibitor (Complete) resuspendiert EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail, Roche)) zur Reinigung. Die resuspendierten Zellen wurden dann auf Eis durch Ultraschall lysiert und unlösliche Materialien wurden durch Zentrifugation entfernt. Der geklärte Überstand, der TetR enthielt, wurde dann mittels His-Tag-Affinitätschromatographie mit einer Ni-NTA-Säule (HisTrap FF 5 ml-Säule, GE Healthcare Life Sciences) und anschließender Größenausschlusschromatographie (Superdex HiLoad 26/600 200 pg-Säule, GE Healthcare Life) gereinigt Wissenschaften) unter Verwendung eines AKTAxpress-Schnellprotein-Flüssigkeitschromatographiesystems. Geklärte Überstände, die TtgR und SmtB enthielten, wurden mittels His-Tag-Affinitätschromatographie mit einer mit Ni-NTA-Agarose beladenen Schwerkraftsäule (Qiagen, Katalog-Nr. 30210) gereinigt. Die eluierten Fraktionen aus der schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie (für TetR) oder aus der Schwerkraftsäule (für TtgR und SmtB) wurden konzentriert und gepuffert (25 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM TCEP, 50 % Glycerin v/v). ) mittels Zentrifugalfiltration (Amicon Ultra-0.5, Millipore Sigma). Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Qubit Protein Assay Kit (Invitrogen, Katalog-Nr. Q33212) bestimmt. Die Reinheit und Größe der Proteine ​​wurden auf einem SDS-PAGE-Gel (Mini-PROTEAN TGX- und Mini-TETRA-Zelle, Bio-Rad) validiert. Gereinigte Proteine ​​wurden bei –20 °C gelagert.

Selbstgemachte IVT-Reaktionen wurden durch Zugabe der folgenden aufgeführten Komponenten in ihrer Endkonzentration durchgeführt: IVT-Puffer (40 mM Tris-HCl pH 8, 8 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 20 mM NaCl und 2 mM Spermidin), 11,4 mM NTPs pH 7,5 , 0,3 U thermostabile anorganische Pyrophosphatase (New England Biolabs, Katalog-Nr. M0296S), Transkriptionsvorlage, DNA-Gate(s) und MilliQ hochreines H2O auf ein Gesamtvolumen von 20 µl. Geregelte IVT-Reaktionen enthielten zusätzlich gereinigtes aTF in der angegebenen Konzentration und wurden etwa 10 Minuten lang bei 37 °C äquilibriert. Unmittelbar vor den Messungen mit dem Plattenlesegerät wurden der Reaktion 2 ng T7-RNAP und optional ein Ligand in der angegebenen Konzentration zugesetzt. Die Reaktionen wurden dann auf einem Plattenlesegerät charakterisiert, wie unter „Quantifizierung des Plattenlesegeräts und Standardisierung von Fluorescein mit mikromolarem Äquivalent“ beschrieben.

Für RNA-Produkte, die auf den Gelbildern der Extended Data Abb. gezeigt werden. 1c, f und 2c, IVT-Reaktionen wurden zunächst wie oben beschrieben aufgebaut. Anschließend wurde eine Phenol-Chloroform-Extraktion und anschließende Ethanolfällung durchgeführt, um sämtliche Proteine ​​zu entfernen. Die Reaktionen wurden dann in 1× TURBO DNase-Puffer mit 2 U TURBO DNase (Invitrogen, Katalog-Nr. QAM2238) auf ein Gesamtvolumen von 20 µl rehydratisiert und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, um die DNA-Gates und die Transkriptionsvorlagen zu entfernen . Zur Entfernung der DNase wurde erneut eine Phenol-Chloroform-Extraktion gefolgt von einer Ethanolfällung durchgeführt und in hochreinem MilliQ-H2O rehydratisiert. Die Konzentrationen der extrahierten RNA-Produkte wurden mit dem Qubit RNA HS-Assay-Kit (Invitrogen, Katalog-Nr. Q32852) gemessen und bis zur weiteren Analyse wie PAGE bei –20 °C gelagert. Für die PAGE-Analyse dieser extrahierten RNA-Produkte wurden 20 % Harnstoff-PAGE-TBE-Gele verwendet und die Gele wurden mit einem ChemiDoc Touch Gel Imaging System (Bio-Rad Image Lab Touch Software v.1.2.0.12) abgebildet.

Vor der Lyophilisierung wurden die Deckel der PCR-Röhrchen mit einer Nadel durchstochen, um drei Löcher zu erzeugen. Anschließend wurde die Lyophilisierung der ROSALIND-Reaktionen durch Zusammenfügen der IVT-Komponenten (oben) unter Zugabe von 50 mM Saccharose und 250 mM d-Mannitol durchgeführt. Die zusammengebauten Reaktionsgefäße wurden sofort in einen vorgekühlten Aluminiumblock überführt und für 10 Minuten in einen Gefrierschrank mit –80 °C gestellt, um ein langsames Einfrieren zu ermöglichen. Nach dem langsamen Einfrieren wurden die Reaktionsgefäße in Kimwipes und Aluminiumfolie eingewickelt, in flüssigen Stickstoff getaucht und dann zur Gefriertrocknung über Nacht bei einer Kondensatortemperatur von –85 °C in ein FreeZone 2,5 L Bench Top Freeze Dry System (Labconco) überführt und 0,04 mbar Druck. Sofern sie nicht sofort rehydriert wurden, wurden gefriergetrocknete Reaktionen wie folgt verpackt. Die Reaktionen wurden in einen vakuumverschließbaren Beutel mit einem Trockenmittel (Dri-Card Desiccants, Uline, Katalog-Nr. S-19582) gegeben, mit Argon unter Verwendung eines Argonkanisters (ArT Wine Preserver, Amazon, Katalog-Nr. 8541977939) gespült und sofort entfernt vakuumversiegelt (KOIOS Vacuum Sealer Machine, Amazon, Katalog-Nr. TVS-2233). Der vakuumversiegelte Beutel wurde dann in einen Lichtschutzbeutel (Mylar-Lebensmittelbeutel mit offenem Ende, Uline, Katalog-Nr. S-11661) gelegt und heißversiegelt (Metronic 8-Zoll Impulse Bag Sealer, Amazon, Katalog-Nr. 8541949845). ) und bis zur Verwendung an einem kühlen, schattigen Ort aufbewahren.

Ein rückverfolgbarer Standard des National Institute of Standards and Technology (Invitrogen, Katalog-Nr. F36915) wurde verwendet, um beliebige Fluoreszenzmessungen in mikromolar äquivalentes Fluorescein (MEF) umzuwandeln. Reihenverdünnungen aus einer 50-µM-Stammlösung wurden in 100 mM Natriumboratpuffer bei pH 9,5 hergestellt, einschließlich einer 100 mM Natriumboratpuffer-Blindprobe (insgesamt 12 Proben). Für jede Konzentration wurden neun Probenreplikate in Dreierchargen erstellt und die Fluoreszenzwerte bei einer Anregungswellenlänge von 495 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm für 6-FAM (Fluorescein)-aktivierte Fluoreszenz oder bei einer Anregungswellenlänge von abgelesen 472 nm und Emissionswellenlänge von 507 nm für durch 3-Wege-Verbindung dimeren Brokkoli (3WJdB) aktivierte Fluoreszenz auf einem Plattenlesegerät (Synergy H1, BioTek Gen5 v.2.04). Fluoreszenzwerte für eine Fluoresceinkonzentration, bei der ein einzelnes Replikat den Plattenleser sättigte, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Die verbleibenden Replikate (neun pro Probe) wurden dann bei jeder Fluoresceinkonzentration gemittelt und der durchschnittliche Fluoreszenzwert des Blindwerts wurde von allen Werten abgezogen. Anschließend wurde eine lineare Regression für Konzentrationen im linearen Fluoreszenzbereich (0–3,125 µM Fluorescein) zwischen den gemessenen Fluoreszenzwerten in willkürlichen Einheiten und der Fluoresceinkonzentration durchgeführt, um den Umrechnungsfaktor zu ermitteln. Für jedes Plattenlesegerät, jede Anregungs-, Emissions- und Verstärkungseinstellung haben wir einen linearen Umrechnungsfaktor gefunden, der verwendet wurde, um beliebige Fluoreszenzwerte mit MEF zu korrelieren (Ergänzende Abbildung 1 und Ergänzende Daten 3).

Zur Charakterisierung wurden 19 µl der Reaktionen mit einer Mehrkanalpipette auf eine optisch klare 384-Well-Platte mit flachem Boden geladen, mit einer Plattendichtung abgedeckt und auf einem Plattenlesegerät (Synergy H1, BioTek Gen5 v.2.04) gemessen. Die kinetische Analyse der durch 6-FAM (Fluorescein) aktivierten Fluoreszenz wurde durch Ablesen der Platte in 1-Minuten-Intervallen mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 495 bzw. 520 nm über 2 Stunden bei 37 °C durchgeführt. Die kinetische Analyse der 3WJdB-aktivierten Fluoreszenz wurde durch Ablesen der Platte in 3-Minuten-Intervallen mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 472 bzw. 507 nm über 4 Stunden bei 37 °C durchgeführt. Beliebige Fluoreszenzwerte wurden dann durch Division mit dem entsprechenden Kalibrierungsumrechnungsfaktor in MEF umgewandelt.

Mit Ausnahme der Daten in Abb. 6b wurde bei der Analyse der Ergebnisse einer Reaktion keine Hintergrundsubtraktion durchgeführt. Ein Beispiel für dieses Standardisierungsverfahren ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.

Die in Abb. 6b gezeigten Daten wurden wie oben generiert und dann mit der folgenden Methode normalisiert, um experimentelle Beobachtungen mit ODE-Simulationen zu vergleichen. Die rohen Fluoreszenzwerte wurden zunächst mit der oben beschriebenen Methode auf MEF (µM Fluorescein) standardisiert. Anschließend wurde der maximale MEF-Wert aller durchgeführten Reaktionen bestimmt (5 Bedingungen × 3 Wiederholungen = 15 Reaktionen). Jeder MEF-Wert in jedem Zeitintervall wurde dann mit der folgenden Formel normalisiert:

Eine Hintergrundsubtraktion wurde durchgeführt, um die für das gelöschte DNA-Signalgatter beobachtete Fluoreszenz ungleich Null zu berücksichtigen. Nachdem alle Daten gemäß der obigen Formel normalisiert wurden, wurde der Durchschnitt von n = 3 Wiederholungen pro Bedingung ermittelt und der entsprechende Standardabweichungswert pro Bedingung berechnet.

Unbeschnittene, unverarbeitete Gelbilder, dargestellt in der ergänzenden Abbildung 2d und den erweiterten Datenabbildungen. 1c,f und 2c sind entweder als Quelldaten oder als Ergänzungsdaten 2 verfügbar und in Mendeley Data (https://doi.org/10.17632/hr3j3yztxb.1) hinterlegt. Die Bandenintensität aus einem mit SYBR-Gold gefärbten Harnstoff-PAGE-Gel in Extended Data Abb. 2c wurde mit Fiji-ImageJ unter Verwendung der herkömmlichen Spurprofilmethode wie zuvor beschrieben berechnet56. Kurz gesagt, ein interessierender Bereich in jeder Fahrspur wurde mithilfe eines Rechtecks ​​mit den gleichen Abmessungen registriert. Der unebene Hintergrund wurde dann durch das Zeichnen einer geraden Linie am unteren Ende jedes Peaks ausgeglichen und die Peakfläche in jeder Spur wurde mit dem Stabwerkzeug berechnet. Die Peakflächen des RNA-Standards wurden dann gegen die geladenen Gesamtmengen aufgetragen, um die Standardkurve in Extended Data Abb. 2d zu erstellen (linearer Bereich: 0,25–2 ng). Unter Verwendung des Umrechnungsfaktors aus der Standardkurve wurden die Konzentrationen der InvadeR-Varianten anhand der mit dem Stab-Tool erhaltenen Peakflächenwerte geschätzt.

Für mit ZnSO4 angereichertes Leitungswasser aus Evanston, IL, wurden zwei Flaschen mit etwa 50 ml der Wasserproben aus einem Trinkbrunnen entnommen. Eine der Flaschen wurde dann mit einem sterilen Vakuumfiltrationssystem Steriflip-GP (Millipore Sigma, Katalog-Nr. SCGP00525) bei 0,22 µm filtriert. Sowohl die gefilterten als auch die ungefilterten Wasserproben wurden mit 10, 1 oder 0,1 mM ZnSO4-Lösung versetzt, die aus dem 2 M ZnSO4-Lösungsstamm verdünnt wurde (Sigma, Katalog-Nr. 83265). Nach der Rehydrierung wurden Fluoreszenzmessungen der Reaktionen mit einem Plattenlesegerät durchgeführt (siehe „Quantifizierung des Plattenlesegeräts und MEF-Standardisierung“). Für mit ZnSO4 versetztes Wasser des Michigansees aus Evanston, Illinois, wurde die gleiche Probenahmemethode angewendet.

ODEs für jede Reaktantenspezies wurden mithilfe der aTF-Bindungs-, IVT- und TMSD-Reaktionskinetik abgeleitet. ODEs wurden mithilfe einer ODE-Solver-Funktion berechnet, odeint aus dem Scipy.Integrate-Paket in Python v.3.7.6. Kinetische Parameter wurden aus der Literatur geschätzt und die Anfangsbedingungen wurden auf experimentelle Bedingungen eingestellt, wobei die Zwischenspezies auf Null gesetzt wurden. Einzelheiten zu den ODE-Simulationen werden in den Zusatzinformationen erläutert.

Die Anzahl der Wiederholungen und die Arten der durchgeführten Wiederholungen werden in der Legende zu jeder Abbildung beschrieben. Es werden einzelne Datenpunkte angezeigt, und wo relevant, wird der Durchschnitt ± Standardabweichung angezeigt. Diese Informationen finden Sie in jeder Abbildungslegende. Die Art der statistischen Analyse, die in Abb. 3d und den erweiterten Daten in Abb. 3 durchgeführt wird, wird in der Legende zu jeder Abbildung beschrieben. Genaue P-Werte sowie die aus der statistischen Analyse berechneten Freiheitsgrade finden Sie in den Quelldaten.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle in dieser Arbeit präsentierten Daten stehen als Quelldaten und als Ergänzungsdaten zur Verfügung. Alle Quelldaten sowie die Zusatzdaten 2 und 3 sind auch in Mendeley Data (doi: 10.17632/hr3j3yztxb.1)57 hinterlegt. Alle in diesem Artikel verwendeten Plasmide sind in Addgene mit den Kennungen 140371, 140374, 140391 und 140395 verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Artikel bereitgestellt.

Die Jupyter Notebook-Dateien mit den Python-Codes, die in Extended Data Abb. 5, Extended Data Abb. 8 und Abb. 6 verwendet werden, werden als Supplementary Data 6 bereitgestellt, und das in diesem Dokument verwendete ODE-Modell wird in den Ergänzenden Informationen beschrieben. Die Python-Codes sind auch in GitHub unter https://git.io/Jtlh1 verfügbar (Ref. 58).

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Jung, JK, Archuleta, CM, Alam, KK Lucks, JB Programmierung zellfreier Biosensoren mit DNA-Strang-Verdrängungsschaltungen. GitHub https://git.io/Jtlh1 (2021).

Referenzen herunterladen

Wir danken A. Thompson (Northwestern University) und C. Knopp (Northwestern University) für die Verwaltung der in dieser Studie verwendeten experimentellen Reagenzien und Geräte; J. Hester (Northwestern University), A. Curtiss (Northwestern University) und J. Mamish (Northwestern University) für hilfreiche Diskussionen zur ADC-Schaltungsarchitektur; S. Schaffter (National Institute of Standards and Technology) für die Manuskriptbearbeitung und hilfreiche Diskussion über TMSD-Schaltkreise; J. Peruzzi (Northwestern University) für Unterstützung bei NanoDrop-Messungen; S. Pshenychnyi (Recombinant Protein Production Core an der Northwestern University) für seine Unterstützung bei der Proteinreinigung. JKJ wurde teilweise vom Graduate School Cluster in Biotechnology, System, and Synthetic Biology der Northwestern University, der dem Biotechnology Training Program angeschlossen ist, durch ein Ryan Fellowship und ein McCormick School of Engineering Terminal Year Fellowship unterstützt. CMA wurde vom Verteidigungsministerium im Rahmen des National Defense Science & Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship-Programms unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch Mittel von NSF CAREER (1452441 an JBL), NSF MCB RAPID (1929912 an JBL), Unterstützung vom Crown Family Center for Jewish and Israel Studies an der Northwestern University (an JBL) und Searle Funds bei The Chicago Community unterstützt Vertrauen (zu JBL).

Abteilung für Chemie- und Bioingenieurwesen, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Jaeyoung K. Jung, Chloé M. Archuleta und Julius B. Lucks

Zentrum für Synthetische Biologie, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Jaeyoung K. Jung, Chloé M. Archuleta und Julius B. Lucks

Zentrum für Wasserforschung, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Jaeyoung K. Jung, Chloé M. Archuleta und Julius B. Lucks

Stemloop, Inc., Evanston, IL, USA

Khalid K. Alam und Julius B. Lucks

Interdisziplinäres Graduiertenprogramm für Biowissenschaften, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Julius B. Lucks

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JKJ, KKA und JBL haben die Studie entworfen. JKJ, CMA und JBL analysierten die Daten. JKJ, CMA und KKA führten die Forschung durch. JKJ, KKA und JBL haben die Methodik entwickelt. JKJ und JBL führten die Visualisierung der Daten durch. JKJ und CMA haben die Software entwickelt. JKJ, KKA, CMA und JBL haben den Artikel geschrieben. JKJ und JBL haben die Daten kuratiert. JBL hat die Finanzierung der Studie eingeworben. JKJ und CMA validierten die Ergebnisse. JKJ und JBL leiteten und koordinierten die Studie. JKJ und JBL überwachten die Forschung.

Korrespondenz mit Julius B. Lucks.

KKA, JKJ und JBL haben eine internationale Patentanmeldung eingereicht, die in den USA (Nr. US 17/309,240) und in Europa (Nr. EP19881824.7) verstaatlicht wurde und sich auf regulierte In-vitro-Transkriptionsreaktionen bezieht. Eine internationale Patentanmeldung (PCT /US2020/030112, Nr. 62/838,852) in Bezug auf die Erhaltung und Stabilisierung von In-vitro-Transkriptionsreaktionen und eine vorläufige US-Anmeldung (PCT/US2020/030112 oder vorläufige US-Nr. 63/154,247) in Bezug auf zellfreie Biosensoren mit DNA-Strang-Verdrängungsschaltkreise. KKA und JBL sind Gründer und haben ein finanzielles Interesse an Stemloop, Inc. Die letztgenannten Interessen werden von der Northwestern University gemäß ihren Richtlinien zu Interessenkonflikten überprüft und verwaltet. CMA erklärt keine konkurrierenden Interessen.

Nature Chemical Biology dankt Jerome Bonnet und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a: In Gegenwart von IVT-Komponenten kann T7-RNAP unspezifisch an die Halteregion des DNA-Signaltors binden. Wenn sich der Haltegriff am 3'-Ende des Gates befindet, führt dies zur Transkription unerwünschter RNA-Nebenprodukte, die den Quencher-Strang verdrängen können. Dieser Vorgang ist blockiert, wenn sich der Fuß am 5'-Ende des Tors befindet. b: Das 3'-Toehold-DNA-Signaltor führt in Gegenwart von T7-RNAP zur Fluoreszenzaktivierung, während das 5'-Toehold-DNA-Signaltor dies nicht tut. c: Wenn die Reaktionsprodukte aus b extrahiert und auf einem Harnstoff-Polyacrylamid-Gel laufen gelassen wurden, erscheinen RNA-Nebenprodukte nur vom 3'-Toehold-DNA-Signaltor. Eine Negativkontrolle, bei der kein DNA-Signalgatter in der Reaktion vorhanden ist (–), wurde sowohl für 3'- als auch für 5'-Toeholds mitgeführt. d: Die Modifizierung des DNA-Gatters mit 2'-O-Methyl-Oligonukleotiden verhindert eine promotorunabhängige Transkription durch T7-RNAP. e: Wenn das 3'-Toehold-DNA-Signaltor mit 2'-O-Methyl-Oligonukleotiden modifiziert wird, wird in Abwesenheit einer T7-RNAP-gesteuerten IVT-Matrize keine Fluoreszenzaktivierung beobachtet. f: Als die Reaktionen aus e auf einem Harnstoff-Polyacrylamid-Gel durchgeführt wurden, wurden keine RNA-Nebenprodukte vom 2'-O-Methyl-DNA-Signaltor beobachtet. Eine Negativkontrolle, bei der kein DNA-Signalgatter in der Reaktion vorhanden ist (–), wurde sowohl für unmodifizierte als auch für modifizierte Gatter mitgeführt. Die in b und e gezeigten Daten sind n = 3 unabhängige biologische Replikate, die jeweils als Linie mit auf MEF (μM Fluorescein) standardisierter Rohfluoreszenz aufgetragen sind. Die Schattierung gibt den Durchschnitt der Replikate ± Standardabweichung an. Die in c und f gezeigten Daten sind repräsentativ für n = 3 unabhängige biologische Replikate. Das in c und f gezeigte unbeschnittene, unbearbeitete Gelbild ist als Quelldaten verfügbar.

Quelldaten

a, Die acht ursprünglich transkribierten Nukleotide jeder InvadeR-Variante in Abb. 2a. Nukleotide, die nicht Teil der InvadeR-Sequenzen sind, sind fett gedruckt und eingefügte Nukleotide sind unterstrichen. b, Konzentrationen jeder Variante aus IVT-Reaktionen, gemessen mit dem Qubit RNA HS-Assay-Kit (Invitrogen, Katalog-Nr. Q32852). Jede Variante wurde in situ in Gegenwart des DNA-Signalgatters 30 Minuten lang produziert und extrahiert (siehe Abschnitt RNA-Extraktion aus IVT-Reaktionen in Materialien und Methoden). Die Konzentration von Variante 1 war für die Qubit-Quantifizierung zu niedrig. c, Die in b gemessenen Proben wurden auf einem Harnstoff-Polyacrylamid-Gel laufen gelassen und mit SYBR-Gold angefärbt. Die Titration eines RNA-Standards ähnlicher Länge wurde durchgeführt, um den linearen Bereich der durch Fiji-ImageJ56 quantifizierten Bandenpeakfläche zu bestimmen. d, Eine Kalibrierungskurve wurde erstellt, indem die aus der Fiji-ImageJ-Quantifizierung berechnete Peakfläche gegen die Gesamtmenge des geladenen Standards aufgetragen wurde. e, Anhand der Kalibrierungskurve in d wurde die Gesamtmenge an RNA für jede Variante bestimmt und mit den von Qubit in b durchgeführten Messungen verglichen. Die Daten in b werden für n = 3 unabhängige biologische Replikate angezeigt, die jeweils als Punkt aufgetragen sind, wobei die Balkenhöhe den Durchschnitt darstellt. Fehlerbalken geben den Durchschnitt der Replikate ± Standardabweichung an. Die in c gezeigten Daten sind repräsentativ für n = 3 unabhängige biologische Replikate. Das in c gezeigte unbeschnittene, unbearbeitete Gelbild ist als Quelldaten verfügbar.

Quelldaten

DNA-Templates, die für InvadeR kodieren, werden so modifiziert, dass sie den T7-Promotor enthalten, gefolgt von einem 2-bp-Spacer und einer aTF-Operatorsequenz stromaufwärts der InvadeR-Sequenz. Sekundärstrukturen, minimale freie Energien und Basenpaarungswahrscheinlichkeiten von a, GG–tetO–InvadeR, b, GG–ttgO–InvadeR und c, GA–smtO–Hairpin2–InvadeR (1BP-Spacer-Variante) werden mit NUPACK bei 37 °C vorhergesagt30. Die GA-smtO-Hairpin2-InvadeR-Sequenz enthält eine Haarnadel, die die strukturelle Beeinträchtigung von InvadeR durch smtO minimieren soll (Extended Data Abb. 4h, i). Die zum Signalgatter komplementäre Sequenz ist mit einer gestrichelten Linie gekennzeichnet und grün schattiert. d, TetR wird zur Erkennung von Tetracyclin verwendet. e, TtgR, ein aTF der MarR-Familie, wird zur Erkennung von Naringenin verwendet. f, SmtB wird zur Erkennung von Zink verwendet. Variationen in der Aktivierungskinetik entsprechen dem Trend, dass die vorhergesagte Sekundärstruktur von InvadeR die Induktionsgeschwindigkeit beeinflusst. Um die Nachweisgrenze jedes Sensors zu bewerten, wurde eine Dosis-Wirkungs-Kurve für g, Tetracyclin, h, Naringenin und i, ZnSO4 (1-Stunden-Endpunktdaten) erstellt. Bei allen gezeigten Daten handelt es sich um n = 3 unabhängige biologische Replikate, die jeweils als Linie (d–f) oder Punkt (g–i) mit rohen Fluoreszenzwerten, standardisiert auf MEF (μM Fluorescein), dargestellt sind. Schattierung (d–f) und Fehlerbalken (g–i) geben den Durchschnitt der Replikate ± Standardabweichung an. Die Ligandenkonzentrationen, bei denen die Signale vom Hintergrund unterscheidbar sind, wurden mithilfe eines zweiseitigen, heteroskedastischen Student-t-Tests gegen die Bedingung ohne Liganden bestimmt, und ihre P-Wertbereiche sind mit Sternchen gekennzeichnet (***P < 0,001, * *P = 0,001–0,01, *P = 0,01–0,05). Genaue P-Werte sowie Freiheitsgrade finden Sie in den Quelldaten. Daten für die Bedingung ohne Liganden wurden ausgeschlossen, da die x-Achse auf der logarithmischen Skala liegt und in den Quelldaten dargestellt wird.

Quelldaten

a, Sekundärstruktur, minimale freie Energie und Basenpaarungswahrscheinlichkeiten von GA-smtO–InvadeR, vorhergesagt von NUPACK bei 37 °C30. Ein Teil der Wildtyp-smtO-Sequenz bildet mit InvadeR eine stark vorhergesagte Stammschleife. Die grün hervorgehobenen Nukleotide entsprechen der InvadeR-Sequenz, die das DNA-Signaltor strangverdrängt. b, Sekundärstruktur, minimale freie Energie und Basenpaarungswahrscheinlichkeiten von GA-smtO–InvadeR–InvadeR, vorhergesagt von NUPACK bei 37 °C30. c, Vergleich der Kinetik der unregulierten GA-smtO-InvadeR-Reaktion und der unregulierten GA-smtO-InvadeR-InvadeR-Reaktion. d, e, NUPACK-vorhergesagte Sekundärstrukturen, minimale freie Energien und Basenpaarungswahrscheinlichkeiten der beiden GA-smtO-Hairpin-InvadeR-Varianten, die die smtO-Sequenz binden und ihre Bindung an InvadeR verhindern sollen. Die grau hervorgehobenen Nukleotide zeigen die hinzugefügte Sequestrierungssequenz an. f, Vergleich der Kinetik der ungeregelten Reaktionen der in d und e gezeigten Varianten. g: Die GA-smtO-Hairpin2-InvadeR-Varianten wurden durch Verlängerung entweder der Stammlänge oder des Abstandshalters zwischen der Haarnadel und der InvadeR-Sequenz erstellt. Die Stammlängenvarianten werden mit dem 0-nt-Spacer erstellt, und die Spacer-Varianten werden mit der 12-bp-Stammlänge erstellt. h, i, Vergleich der Kinetik der unregulierten Reaktionen der GA-smtO–Hairpin2–InvadeR-Varianten. Bei allen gezeigten Daten handelt es sich um n = 3 unabhängige biologische Replikate, die jeweils als Linie mit rohen Fluoreszenzwerten, standardisiert auf MEF (μM Fluorescein), dargestellt sind. Schattierungen geben den Durchschnitt der Replikate ± Standardabweichung an.

Quelldaten

Simulationen von Logikgattern, die in den Abbildungen besprochen werden. 4, 5 und erweiterte Daten Abb. 7 werden zusammen mit den erwarteten simulierten Flugbahntrends angezeigt. Alle zur Simulation der Ergebnisse verwendeten Jupyter-Notebook-Codes sind als Supplementary Data 6 verfügbar, und die Methode zur Entwicklung des ODE-Modells für jedes repräsentative Logikgatter wird in den Supplementary Information erläutert.

Quelldaten

a, Die Sequenz und das Design des in Abb. 4c gezeigten DNA-AND-Gatters. Die Fehlpaarungen wirken als thermodynamischer Treiber, der die Reaktion vorantreibt. Die Klemmdomäne verhindert, dass der obere Strang nur mit Eingang 1 (orange) verdrängt wird. b: Ohne thermodynamische Treiber wird kein Signal beobachtet. Durch Verlängern der Klemme wird das Leck um Eingabe 1 verringert. Das Leck wird bei der ac-, 3-bp-, d-, 5-bp- und e-, 7-bp-Klemme beobachtet. f, Die Sequenzen und Designs von InvadeR- und RNA-NOT-Gattern ohne Operatorsequenzen. Die Nichtübereinstimmung zwischen InvadeR und dem Signal-Gate wird rot hervorgehoben. Variante 2 enthält 6 zusätzliche Adenine, die ihre Interaktionen mit dem NOT-Gatter verstärken. NICHT-Tor 1 hat einen 4-Nächte-Zugang, während NICHT-Tor 2 und 3 6-Nächte-Zugang haben. NOT-Gate 3 verfügt nach den initiierenden Guaninen über ein zusätzliches Adenin, das seine Transkriptionseffizienz erhöht36. Titration des Templates, das NOT-Gate 1 codiert, in Gegenwart von 25 nM des Templates, das InvadeR g, Variante 1 und h, Variante 2 codiert. Während Variante 2 mehr NOT-Gate-Template benötigt, um das Signal zu blockieren, wird bei Variante 2 ein stärkeres Signal beobachtet ohne das NOT-Gatter. Titration des Templates, das NOT-Gate i, 2 und j, 3 kodiert, in Gegenwart von 25 nM des InvadeR-Variante-2-Templates. NOT-Gate 2 und 3 sind bei der Sequestrierung von InvadeR effizienter als NOT-Gate 1. k, Die Integration der Operatorsequenz in das NOT-Gate wirkt sich auf dessen Struktur aus. NUPACK sagt voraus, dass die smtO-Sequenz (hellgrau) mit einem Teil von NOT-Gate 3 interagiert und den Toehold blockiert30. Eine Spacer-Sequenz (unterstrichen) kann die erwartete Struktur des NOT-Gatters wiederherstellen. Titration des Templates, das l, smtO-NOT-Gate 3 und k, smtO-Spacer-NOT-Gate 3 kodiert, in Gegenwart von 25 nM des InvadeR-Variante-2-Templates. Alle gezeigten Reaktionen sind unreguliert. Bei allen gezeigten Daten handelt es sich um n = 3 unabhängige biologische Replikate, die jeweils als Linie mit auf MEF (µM Fluorescein) standardisierter Rohfluoreszenz dargestellt sind. Die Schattierung gibt den Durchschnitt der Replikate ± Standardabweichung an.

Quelldaten

a, Tetracyclin-induziertes NOT-Gate, dargestellt in Abb. 4e. b: Eine Vorlage, die die gemischte Sequenz des TetR-regulierten NOT-Gatters kodiert, wurde als Kontrolle verwendet, um zu zeigen, dass die durch Tetracyclin induzierte Signalreduzierung nicht auf Ressourcenbeschränkungen zurückzuführen ist. c, ZnSO4-induziertes NOT-Gate kann auf die gleiche Weise entworfen werden. Die Spacer-Sequenz wurde hinzugefügt, um zu verhindern, dass die smtO-Sequenz die NOT-Gate-Struktur stört (Extended Data Abb. 6). d, In Gegenwart von ZnSO4 wird das Fluoreszenzsignal deaktiviert. In ähnlicher Weise werden Kontrollreaktionen mit einer Vorlage gezeigt, die die gemischte Sequenz des SmtB-regulierten NOT-Gatters kodiert. e, Ein tet IMPLY ZnSO4-Gate, das wie in Abb. 5c beschrieben konstruiert ist. f: Es wird eine Fluoreszenzaktivierung beobachtet, sofern nicht nur Tetracyclin hinzugefügt wird. g: Ein tet-IMPLY-ZnSO4-Gate kann alternativ durch die Einbindung einer ZnSO4-induzierbaren Vorlage aufgebaut werden, die mit dem Signal-Gate statt mit dem OR-Gate interagiert. h, Das alternative IMPLY-Gatter führt die erwartete Logikberechnung durch. Es wird eine schnellere Signalerzeugung aus den ZnSO4-induzierten Bedingungen beobachtet, da die ZnSO4-induzierten RNA-Stränge direkt TMSD am Signaltor durchführen. i, Der alternative Ansatz zum Aufbau des IMPLY-Gatters kann auf das ZnSO4-IMPLY-Tet-Gatter angewendet werden, und j, das Gatter führt die erwartete Logikberechnung durch. k, Ein tet NIMPLY ZnSO4-Gate ist auf die gleiche Weise konstruiert wie das in Abb. 5g gezeigte ZnSO4 NIMPLY tet-Gate. l, Das tet NIMPLY ZnSO4-Gate führt die erwartete Logikberechnung durch. Alle in dieser Abbildung verwendeten Versuchsbedingungen finden Sie in den Zusatzdaten 5. Alle gezeigten Daten sind n = 3 unabhängige biologische Replikate, die jeweils als Linie mit auf MEF (µM Fluorescein) standardisierter Rohfluoreszenz aufgetragen sind. Die Schattierung gibt den Durchschnitt der Replikate ± Standardabweichung an.

Quelldaten

Die kinetischen Spuren, die den in Abb. 6e gezeigten Daten entsprechen, werden für das 8-nt-Schwellenwert-Gate in unterschiedlichen Verhältnissen oberhalb einer festen Signal-Gate-Konzentration (a, 0X, b, 1X, c, 2X und d, 3X-Schwelle) dargestellt. Der Zeitpunkt (t = 100 min), zu dem die Heatmap erstellt wurde, wird durch eine vertikale gepunktete Linie angezeigt. Die Unterschiede in der Reaktionsgeschwindigkeit für unterschiedliche Zinkkonzentrationen sind für die Erstellung des Standards von wesentlicher Bedeutung. e: Die Zinkbedingungen von 10 μM und 30 μM zeigen keine kinetischen Unterschiede ohne Schwellenwert-Gate. f, g, Die Funktionscharakterisierung und ODE-Vorhersagen der ADC-Schaltung nach 100 Minuten aus Abb. 6e, d, einschließlich der 30 μM Zink- und 4X-Schwellenwertbedingungen. Die 10 μM- und 30 μM-Zink-Bedingungen verhalten sich aufgrund ihres identischen kinetischen Verhaltens, das in z. B. beobachtet wurde, identisch, wie vom ODE-Modell vorhergesagt. h, Die entsprechenden Balkendiagrammdaten des in f gezeigten semiquantitativen Standards. Bei allen gezeigten Daten handelt es sich um n = 3 unabhängige biologische Replikate, die jeweils als Linie (a–e) oder Punkt (h) mit rohen Fluoreszenzwerten, standardisiert auf MEF (μM Fluorescein), dargestellt sind. Die Balken in h und die Werte auf der Heatmap in f stellen Durchschnittswerte der Replikate dar. Schattierungen in a–e und Fehlerbalken in h geben den Durchschnitt der Replikate ± Standardabweichung an.

Quelldaten

Nicht regulierte Reaktionen wurden über Nacht unter Zugabe von 50 mM Saccharose und 250 mM D-Mannitol als Gefrierschutzmitteln lyophilisiert, sofern nicht anders angegeben. Die lyophilisierten Reaktionen wurden dann in einem leichten Schutzbeutel mit einer Dri-Card vakuumverpackt und bis zur Verwendung an einem kühlen, schattigen Ort aufbewahrt (das detaillierte Protokoll finden Sie unter Materialien und Methoden). Es werden kinetische Spuren von Rehydratationsreaktionen nach a, 1 Tag, b, 4 Tagen und c, 7 Tagen Lagerung gezeigt. Im Laufe der Zeit nehmen sowohl das Gesamtsignal als auch die Reaktionsgeschwindigkeit ab. Um die Ursache des Signalverlusts im Laufe der Zeit zu untersuchen, wurde das DNA-Signal-Gate allein über Nacht mit oder ohne Gefrierschutzmittel lyophilisiert, verpackt und wie oben beschrieben gelagert. Das DNA-Signaltor wurde mit den restlichen IVT-Komponenten nach d, 1 Tag, e, 4 Tagen und f, 7 Tagen rehydratisiert. Die Reaktionsgeschwindigkeit und die Stärke des Signals bleiben erhalten, was darauf hindeutet, dass der Signalverlust wahrscheinlich auf die Instabilität bestimmter IVT-Komponenten zurückzuführen ist. Um diese Hypothese zu testen, wurden unregulierte Reaktionen mit Tris-gepufferten NTPs anstelle von NaOH-gepufferten NTPs mit den Gefrierschutzmitteln lyophilisiert, verpackt und wie oben beschrieben gelagert. Es werden kinetische Spuren von Rehydratationsreaktionen nach g, 1 Tag, h, 4 Tagen und i, 7 Tagen Lagerung gezeigt. Der Signalverlust wird bei Tris-gepufferten NTPs etwas gemildert, ein ähnlicher Signalverlust wird jedoch bei der Langzeitlagerung lyophilisierter Reaktionen beobachtet. Bei allen gezeigten Daten handelt es sich um n = 3 unabhängige biologische Replikate, die jeweils als Linie mit rohen Fluoreszenzwerten, standardisiert auf MEF (μM Fluorescein), dargestellt sind. Schattierungen geben den Durchschnitt der Replikate ± Standardabweichung an.

Quelldaten

Zinkempfindliche ROSALIND mit TMSD-Reaktionen, die smtO-InvadeR-InvadeR verwenden, wie in Abb. 4b der erweiterten Daten gezeigt, wurden gefriergetrocknet und mit a, Leitungswasser und b, Lake Michigan-Wasser, angereichert mit verschiedenen Konzentrationen von ZnSO4, rehydriert. Die Reaktionen wurden dann 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und auf Fluoreszenz charakterisiert. Für jeden Wasserprobentyp wurde das Signal mit dem der Reaktionen verglichen, die mit Wasser in Laborqualität rehydriert wurden, das mit der gleichen Menge ZnSO4 versetzt war. In jedem Fall verliefen die Reaktionen wie erwartet und es gab keinen Unterschied im Signal zwischen gefilterten und ungefilterten Wasserproben. Allerdings ist bei den realen Wasserproben im Vergleich zu denen, die mit dem mit ZnSO4 angereicherten Wasser in Laborqualität rehydratisiert wurden, eine leichte Signalreduzierung zu beobachten, was wahrscheinlich auf Matrixeffekte zurückzuführen ist. Bei allen gezeigten Daten handelt es sich um n = 3 unabhängige biologische Replikate, die jeweils als Punkt mit auf MEF (μM Fluorescein) standardisierten Rohfluoreszenzwerten aufgetragen sind. Jede Balkenhöhe stellt den Durchschnitt der Replikate dar, und Fehlerbalken geben den Durchschnitt der Replikate ± Standardabweichung an.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen. 1–5 und Methode zur ODE-Modellierung, die in dieser Studie verwendet wird.

In dieser Studie verwendete DNA- und Proteinsequenzen.

Rohes Harnstoff-PAGE-Gelbild, dargestellt in der ergänzenden Abbildung 2d.

Kalibrierte Plattenlesedaten für ergänzende Abbildungen.

Designs und Sequenzen aller in dieser Studie gebauten Logikgatter und ihre Quellen.

Experimentelle Bedingungen (Liganden, aTFs, DNA-Templates und DNA-Gatter-Konzentrationen), die für alle Logikgatter und ihre kinetischen Parameter verwendet wurden, die für die ODE-Simulationen verwendet wurden.

Jupyter-Notebook-Codes zur Simulation der in Extended Data 5, Extended Data 8 und Abb. 6 gezeigten Ergebnisse.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für Abb. 2.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für Abb. 3.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für Abb. 4.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für Abb. 5.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für Abb. 6.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für erweiterte Daten Abb. 1.

Unverarbeitete, nicht zugeschnittene Harnstoff-PAGE-Gele, dargestellt in Extended Data Abb. 1 und ihren Kurzbeschreibungen.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für erweiterte Daten, Abb. 2.

Unverarbeitetes, nicht zugeschnittenes Harnstoff-PAGE-Gel, dargestellt in Extended Data Abb. 2 und seiner Kurzbeschreibung.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für erweiterte Daten, Abb. 3.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für erweiterte Daten, Abb. 4.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für erweiterte Daten, Abb. 5.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für erweiterte Daten, Abb. 6.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für erweiterte Daten Abb. 7.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für erweiterte Daten Abb. 8.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für erweiterte Daten Abb. 9.

Kalibrierte Quelldaten des Plattenlesegeräts für erweiterte Daten, Abb. 10.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jung, JK, Archuleta, CM, Alam, KK et al. Programmierung zellfreier Biosensoren mit DNA-Strang-Verdrängungsschaltkreisen. Nat Chem Biol 18, 385–393 (2022). https://doi.org/10.1038/s41589-021-00962-9

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Eingegangen: 29. Januar 2021

Angenommen: 16. Dezember 2021

Veröffentlicht: 17. Februar 2022

Ausgabedatum: April 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41589-021-00962-9

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Naturchemische Biologie (2022)